تصور حركة الحويصلة في الخلايا العصبية باستخدام التصوير الفلوري

Abstract

المصدر: Tsuruta، F.، et al. القياس الكمي لحركات الجسيمات الداخلية والليزوسوم في الخلايا العصبية المستنبتة باستخدام مجسات الفلورسنت. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو كيف يتم تصنيف الحويصلات العصبية ببروتينات فلورية محددة لتصور حركتها. أولا ، يتم تحضين ترميز البلازميد لبروتين الفلورسنت بعامل تعداء ثم يتم إدخاله في ثقافة الخلايا العصبية. بعد ذلك ، يتم الحصول على صور الخلايا العصبية وتحليلها لتتبع حركة الحويصلات.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تصوير حركة الحويصلة

1. قم بإعداد البلازميدات التي ستسمي كل نوع من أنواع الحويصلات. على سبيل المثال ، استخدم EGFP-Rab5 للجسيمات الداخلية المبكرة ، و EGFP-Rab7 للجسيمات الداخلية المتأخرة ، و LAMP-EGFP للجسيمات الحالة ، و EGFP-LC3 للجسيمات الذاتية.
   ملاحظه: هذه البلازميدات متوفرة عند الطلب من tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. عادة ، يمكن نقل الخلايا العصبية في المختبر (Division أو DIV) لمدة 3-5 أيام باستخدام هذه البلازميدات باستخدام كواشف التعداد.
2. امزج 4.0 ميكروغرام من البلازميدات مع 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل عن طريق سحب العينات. في أنبوب منفصل ، قم بتخفيف 8 ميكرولتر من كاشف التعدي (انظر جدول المواد) في 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل. احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. امزج محلول البلازميد ومحلول إعادة النعداء في الخطوة 1.2 عن طريق سحب العينات. احتضن لمدة 20 دقيقة في RT.
4. أضف وسطا خاليا من المصل و 400 ميكرولتر من محلول البلازميد من الخطوة 1.3 إلى كل طبق مطلي بقاع زجاجي يحتوي على الخلايا العصبية القشرية ، ووسط الثقافة القشرية الدماغية. احتضان الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5٪ لمدة} 30 دقيقة. استبدل الوسط ب 2 مل من وسط الثقافة القشرية الدماغية. احتضان الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5٪ لمدة} 1-2 أيام.
   ملاحظه: قم بإعداد وسط ثقافة قشرية دماغية يتكون من وسط قاعدي خلفي عصبي مكمل ب 1x B-27 ، و 2 ملي مولار L-glutamine ، و 100 U / مل بنسلين ستربتومايسين.
5. بعد 1-2 أيام من التعدي ، حدد الخلايا المنقولة للحصول على الصور.
   ملاحظه: تميل الخلايا العصبية المبكرة التي تقل عن 7 DIV إلى إظهار حركة الحويصلة الديناميكية. حدد الخلايا العصبية التي تعبر بشكل معتدل عن مسبار التألق لأنه لا يمكن الحصول على صور واضحة عند اختيار خلية عصبية عالية التعبير. أيضا ، حدد شكلا عصبيا نموذجيا ، مثل الخلايا العصبية الهرمية ، التي تحتوي على محاور طويلة وتشعبات معقدة ، لسهولة التعرف على المحور العصبي والتشعبات (انظر الشكل 1 أ).
6. الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير بفاصل زمني: للتصوير ، استخدم مجهر مضان مزود بكاميرا جهاز مقترن بالشحن (CCD) مع عدسات موضوعية 40X Plan Apo 0.95NA أو 100X Plan Apo VC NA1.4. تحكم في درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية باستخدام نظام الحضانة. الحصول على صور الخلايا العصبية في إطار واحد / 5 ثوان على مدى 100 ثانية يتحكم فيها برنامج الحصول على الصور. بدلا من ذلك، احصل على صور على فترات زمنية أقصر ولفترات زمنية أطول، مثل إطار واحد لكل 2 ثانية خلال فترة 300 ثانية.
   ملاحظه: تتوفر مجموعة متنوعة من التطبيقات لالتقاط صور متسلسلة ، والعديد منها سيكون مناسبا لهذه الطريقة. لذلك ، لا يوصى بتطبيق معين. بدلا من ذلك ، يجب على كل باحث استخدام أي تطبيق متاح.

< p class = "jove_title" >2. تحليل الصور

1. افتح جميع الصور المتسلسلة في برنامج ImageJ باستخدام التتبع اليدوي.
   ملاحظه: حتى الآن ، تم استخدام التتبع اليدوي على نطاق واسع في تتبع التجارب. تم تطوير التتبع اليدوي بواسطة الدكتور فابريس كورديليير. التعليمات المكتوبة التفصيلية متاحة على الإنترنت. للتحليل ، يتم تحسين جودة بيانات التصوير بعدد كاف من الصور. يوصى باستخدام أكثر من 20 صورة.
2. لدمج الصور المتسلسلة، اختر→ → . نقر.
3. اختر → ؛ ستظهر نافذة تتبع.
4. انقر فوق خانة الاختيار وحدد معلمات التتبع في قسم المعلمات.
   ملاحظه: يمكن تعيين العديد من المعلمات ، بما في ذلك الفاصل الزمني ، ومعايرة x / y ، ومعايرة z ، وحجم مربع البحث للتوسيط ، وحجم النقطة ، وعرض الخط ، وحجم الخط. في هذا الفحص المبسط ، تم تحديد كل من الفاصل الزمني ومعايرة x / y. في ظل ظروف تجريبية أخرى ، قد يكون من الضروري تحديد معلمات أخرى أيضا. المعلمات المستخدمة هنا هي كما يلي: ال هو 5 ثوان ، وإما 0.26642 ميكرومتر لعدسة موضوعية 40X Plan Apo 0.95NA أو 0.10657 ميكرومتر لعدسة موضوعية 100X Plan Apo VC NA1.4.
5. بعد تحديد المعلمات ، انقر فوق لبدء مسار جديد.
6. بعد تحديد الحويصلات ذات الأهمية (على سبيل المثال ، الحويصلات المشار إليها برؤوس الأسهم الزرقاء والحمراء في الشكل 1 أ (اللوحة اليمنى)) ، انقر فوق مركز الإشارات في الصور المتسلسلة لتسجيل إحداثيات xy. تظهر نتائج إحداثيات xy المسجلة والمسافة والسرعة في نافذة جديدة.
   ملاحظه: في حالة الجسيمات الحالة ، غالبا ما يتم ملاحظة إشارات الفلورسنت الساطعة الكبيرة (على سبيل المثال ، الشكل 1 أ (اللوحة اليمنى) ، رأس السهم البرتقالي) في الخلايا العصبية. تظهر هذه الإشارات أحيانا إما حويصلات متراكمة أو دوالي مرضية ، لذلك يجب تجنب هذه الإشارات لقياس الحركة.
7. كرر الخطوة 2.6 لجمع إحداثيات xy للحويصلات من جميع الصور المتسلسلة؛ بعد تحديد النقطة المرجعية، تتقدم كل صورة تلقائيا إلى الصورة المتتالية.
8. تصدير هذه البيانات إلى جدول جديد (على سبيل المثال، جدول بيانات). استخدم البرنامج المناسب لإنشاء رسم بياني مناسب (انظر جدول المواد).
   ملاحظه: لتحليل البيانات ، حدد العمود ، ولخص جميع قيم هذا العمود ، واعرض مسافة الحركة كرسم بياني شريطي ، كما هو الحال في الشكل 1 ب. بالإضافة إلى ذلك ، كرر هذه الخطوة ، واحسب متوسط مسافة الحركة الإجمالية ، وأظهرها كرسم بياني شريطي ، كما في الشكل 1C. يتم عرض برنامج إنشاء رسم بياني شريطي وبيانات شكل موجي في جدول المواد.

Results

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: حركة الجسيمات الليزومية في التشعبات العصبية. (أ) تم نقل الخلايا العصبية القشرية للفأر (4 DIV) باستخدام بلازميد LAMP-EGFP لمدة يومين. توضح هذه الصورة حركة الحويصلات المحتوية على LAMP-EGFP في التشعبات. يظهر الجزء الداخلي صورة الفاصل الزمني للحويصلات الموجبة LAMP-EGFP. يشير رأس السهم الأحمر إلى حويصلة متحركة ، ويشير رأس السهم الأزرق إلى حويصلة مسترحة. تشير رؤوس الأسهم البرتقالية إلى ...

Materials