القياس الكمي لتوزيع بروتين ما قبل المشبكي في دماغ الفأر باستخدام التألق المناعي

الملخص

المصدر: Wallrafen، R.، et al. تحديد التوزيع غير المتجانس لبروتين متشابك في دماغ الفأر باستخدام التألق المناعي. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تلطيخ التألق المناعي لشريحة دماغ الفأر لتحديد توزيع بروتين معين قبل المشبكي. تتضمن العملية حجب المواقع غير المحددة ، وتطبيق الأجسام المضادة الأولية للبروتين المستهدف وعلامة مرجعية ، متبوعا بوضع العلامات الثانوية على الأجسام المضادة والتلوين النووي. تضمن العلامة المرجعية القياس الكمي الدقيق من خلال توفير خط أساس ثابت ، ويتم تحليل توزيع البروتين قبل المشبكي عبر مناطق الدماغ باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< ص الفئة = "jove_title" >1. التألق المناعي

1. قم بإعداد المحاليل بما في ذلك المخزن المؤقت للانسداد ، ومخزن الأجسام المضادة ، ومخزن الغسيل 1 ، ومخزن الغسيل 2 (انظر الجدول 1).
2. اشطف الشرائح مرة واحدة باستخدام عازلة الفوسفات (PB) لإزالة مركب درجة حرارة القطع المثلى الزائدة (OCT).
   1. قم بإزالة المحلول بماصة بلاستيكية دون امتصاص شرائح الدماغ. أضف 250 ميكرولتر من PB الطازج مع ماصة 1000 ميكرولتر.
      أنذر: يجب ألا تجف الشرائح ، لذا قم بإزالة السوائل وإضافتها جيدا.
3. قم بإزالة PB بماصة بلاستيكية وأضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لكل بئر باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. احتضان لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر.
4. خلال فترة الحضانة ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية في مخزن الأجسام المضادة في أنبوب التفاعل. استخدم 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للجسم المضاد لكل بئر وأضف الكمية المناسبة من الجسم المضاد (انظر الجدول 2) عن طريق ماصته مباشرة في المحلول باستخدام ماصة 2 ميكرولتر. امزج المحلول عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات. دوامة بعد ذلك بوقت قصير لضمان الخلط المناسب.
   ملاحظه: لتحديد مضان الخلفية ، يجب أيضا إجراء التلوين دون إضافة الجسم المضاد الأساسي. لذلك ، احتضان الشريحة في محلول الأجسام المضادة بدون أجسام مضادة أولية وفقا للبروتوكول.
5. بعد وقت الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت المانع بماصة بلاستيكية وأضف 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة التي تحتوي على أجسام مضادة أولية لكل بئر. احتضان الشرائح بالجسم المضاد الأولي طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر.
6. في اليوم التالي ، اغسل الشرائح بمحلول غسيل 1 3x لمدة 10 دقائق في RT على شاكر.
   1. قم بإزالة الوسط بماصة بلاستيكية وأضف 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1 لكل بئر. احتضن في RT لمدة 10 دقائق. كرر 3 مرات.
7. أثناء خطوات الغسيل ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بالفلوروفور في عازلة الجسم المضاد في أنبوب التفاعل. استخدم 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للجسم المضاد لكل بئر وأضف الكمية المناسبة من الجسم المضاد (انظر الجدول 2) عن طريق ماصته مباشرة في المحلول باستخدام ماصة 2 ميكرولتر. امزج المحلول عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات. دوامة بعد ذلك بوقت قصير لضمان الخلط المناسب.
   أنذر: نظرا لأن الأجسام المضادة حساسة للضوء ، يجب تنفيذ جميع الخطوات من هذه النقطة فصاعدا في الظلام.
8. بعد خطوات الغسيل ، قم بإزالة مخزن الغسيل المؤقت بماصة بلاستيكية وأضف 250 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الذي يحتوي على أجسام مضادة ثانوية لكل بئر. احتضان الشرائح بجسم مضاد ثانوي لمدة 90 دقيقة في RT في الظلام.
9. اغسل الشرائح بمحلول غسيل 2 3x لمدة 10 دقائق في RT.
10. أثناء خطوات الغسيل ، قم بتخفيف 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) في 0.1 M PB بتركيز 1: 2000.
11. قم بإزالة عازلة الغسيل 2 بماصة بلاستيكية وأضف 250 ميكرولتر من محلول DAPI لكل بئر. احتضن لمدة 5 دقائق في RT على شاكر.
12. قم بإزالة محلول DAPI باستخدام ماصة بلاستيكية وأضف 500 ميكرولتر من 0.1 M PB لكل بئر باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
13. قم بتركيب الشرائح على شرائح المجهر.
    1. ضع شريحة مجهر تحت المجسم. باستخدام فرشاة ناعمة ، أضف ثلاث قطرات منفصلة من 0.1 M PB على الشريحة. ضع شريحة واحدة لكل قطرة على شريحة المجهر.
    2. استخدم الفرشاة الدقيقة لتسطيح الشرائح وتوجيهها على شريحة المجهر.
    3. عندما يتم وضع جميع الشرائح بشكل صحيح ، قم بإزالة PB الزائد بمنديل وجفف الشريحة بعناية.
       أنذر: تجنب تجفيف شرائح الدماغ تماما.
    4. أضف 80 ميكرولتر من وسط التضمين على الشريحة. قم بخفض الغطاء بعناية على الشريحة ، وبالتالي تضمين شرائح الدماغ.
    5. اترك الشرائح لتجف في غطاء الدخان لمدة 1-2 ساعة (قم بتغطيتها لتجنب التعرض للضوء) وقم بتخزينها في صندوق منزلق مجهر عند 4 درجات مئوية.
       ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

< p class = "jove_title" >2. التصوير

1. بعد تقوية وسط التضمين تماما ، ضع شريحة المجهر تحت المجهر متحد البؤر.
   ملاحظه: يجب أن ينتج عن الفحص المجهري الفلوري جنبا إلى جنب مع برنامج إزالة الالتفاف جودة صورة مماثلة.
2. اضبط إعدادات الليزر عن طريق زيادة أو تقليل شدة الليزر لكل قناة بحيث يتم تعريض عدد قليل من وحدات البكسل بشكل مفرط لضمان أقصى توزيع للقيم الرمادية.
3. احصل على أنسجة افتراضية لشريحة الدماغ بأكملها للقنوات المختلفة.
   1. في برنامج التصوير، حدد خيار البلاط وحدد شريحة الدماغ يدويا باستخدام إعداد منطقة البلاط.
   2. قم بتوزيع نقاط الدعم في جميع أنحاء منطقة التجانب واضبط التركيز لنقاط الدعم المختلفة بالضغط على التحقق من مناطق/مواضع التجانب....
   3. اضبط الإعدادات في وضع الاكتساب وفقا للدقة المطلوبة وحجم الملف للصورة الناتجة وابدأ الفحص.
4. عند الانتهاء من الفحص ، استخدم وظيفة الخياطة لمعالجة الأنسجة الافتراضية. قم بتصدير الملف كملف .tif باستخدام الدالة Image Export.

3. التحليل المستند إلى الكمبيوتر

1. قم بتحميل جميع القنوات الفردية لصورة واحدة في فيجي بالنقر فوق ملف | مفتوح.
2. باستخدام أداة التحديد اليدوية الحرة، حدد نصف كرة واحد في قناة DAPI. قم بإنشاء قناع للتحديد بالنقر فوق تحرير | الاختيار | إنشاء قناع.
3. حدد متوسط شدة التألق للقنوات المفردة (المحرك والمشبك الطبيعي) بالنقر فوق تحليل | القياس.
   ملاحظه: تأكد من تحديد القنوات المختلفة لتحديد متوسط قيم شدة التألق لكل قناة.
4. انسخ متوسط شدة التألق للقنوات الفردية في جدول بيانات.
5. حدد متوسط شدة التألق للقنوات المفردة في منطقة الاهتمام من خلال تحديد المنطقة أيضا باستخدام أداة الاختيار اليدوية. استخدم أطلس دماغ الفأر كمرجع.
6. كرر الخطوات 3.1-3.5 لجميع نصفي الكرة الأرضية وجميع مجالات الاهتمام.
   ملاحظه: حدد قيم كل نصف كرة على حدة من أجل مقارنة القيم في مجال الاهتمام لاحقا بتلك الموجودة في نصف الكرة الأرضية (انظر الخطوة 4.2).

4. معالجة البيانات

1. في حالة ارتفاع مضان الخلفية ، قد تكون هناك حاجة إلى طرح الخلفية. لذلك ، حدد متوسط شدة التألق للشريحة المعالجة بدون جسم مضاد أولي ضد البروتين المرجعي (هنا: synaptophysin) واطرح تلك القيمة من جميع القيم التي تم الحصول عليها لمناطق الدماغ ونصفي الكرة الأرضية.
2. عندما يتم تحديد متوسط شدة التألق للقنوات المفردة لكل نصف كرة وكل مجال اهتمام (انظر الجدول 3) ، احسب نسبة المحرك إلى المشبك بقسمة قيمة المحرك على قيمة synaptophysin (أصفر في الجدول 3). قم بتنفيذ هذا الإجراء لكل نصف كرة وكل مجال اهتمام على حدة.
3. اقسم النسبة التي تم الحصول عليها لمنطقة اهتمام واحدة على النسبة التي تم الحصول عليها لنصف الكرة الأرضية المقابل (برتقالي في الجدول 3) لتحديد نسبة منطقة الاهتمام إلى نصف الكرة الأرضية.
4. لتحديد وفرة المحرك النسبي ، قم بترجمة النسبة التي تم الحصول عليها في 4.2 إلى نسبة مئوية عن طريق تحديد انحرافها عن 1 (الأحمر في الجدول 3). وبالتالي فإن نسبة 1.25 ستعطي وفرة نسبية للمحرك بنسبة 25٪ أعلى من المتوسط ، ونسبة 0.75 ستؤدي إلى وفرة نقل نسبية بنسبة 25٪ أقل من المتوسط.

الجدول 1: الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

مثبت (500 مل) امزج 20 جم بارافورمالدهيد (إجمالي الكونسي: 4٪)
50 مل 10x PBS حل الأسهم (إجمالي conc: 1x)
450 مل بيدست H₂Oالرقم الهيدروجيني فقط إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم
ملاحظة: لحل بارافورمالدهيد في PBS ، قم بتسخين المحلول. لا تسخن أكثر من 70 ^درجةمئوية ، حيث يتفكك PFA في درجات حرارة أعلى من 70 ^درجةمئوية
تحذير: حمض PFA سام ، ومن المحتمل أن يكون مسرطن ومجيئا. ارتد قفازات عند العمل مع PFA واعمل تحت غطاء الدخان. تجنب الابتلاع. 0.1 ميجا PB (1 لتر) حل المخزون X
35.61 جم Na₂HPO 4.2H ₂O في 1 L bidest H₂O حل المخزون Y
27.60 جم هيدروهيدرات_{هيدروكسيد 2}PO_{4.2H 2}O في 1 لتر بيدست H₂O مزيج 385 مل محلول مخزون X
115 مل محلول مخزون Y
500 مل بيدست H₂O مانع مؤقت (50 مل) امزج 1.25 مل من مصل الماعز العادي (إجمالي القوالب: 2.5٪)
1.25 مل مصل حمار عادي (إجمالي الكونسيف: 2.5٪)
0.5 مل خافض للتوتر السطحي غير أيوني (Triton-X100 ، إجمالي القوالب: 1٪)
47 مل 0.1 م PB عازلة للجسم المضاد (50 مل) امزج 0.25 مل من مصل الماعز العادي (إجمالي التركيب: 0.5٪)
0.25 مل مصل حمار عادي (إجمالي التركيب: 0.5٪)
0.1 مل خافض للتوتر السطحي غير أيوني (إجمالي التركام: 0.2٪)
49.4 مل 0.1 م PB عازلة الغسيل 1 (50 مل) امزج 1 مل من مصل الماعز العادي (إجمالي الاتصالات: 2٪)
49 مل 0.1 م PB عازلة الغسيل 2 (50 مل) امزج 0.5 مل من مصل الماعز العادي (إجمالي التركيب: 1٪)
49.5 مل 0.1 م PB

الجدول 2: الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول.

الأجسام المضادة الأولية موجه ضد الأنواع المضيفة RRID تركيز المحرك أرنب AB_10804285 1:1000 Synaptophysin خنزير غينيا AB_1210382 1:1000 الأجسام المضادة الثانوية الأنواع المستهدفة الأنواع المضيفة فلوروفور تركيز أرنب حمار أليكسا فلور 647 1:1000 خنزير غينيا ماعز أليكسا فلور 488 1:1000

الجدول 3: مثال على معالجة البيانات.

نصف الكرة الأرضية نصف الكرة # متوسط شدة التألق Synaptophysin (A.U.) متوسط شدة التألق المحرك (A.U.) نسبة المحرك / Synaptophysin 1
2< / > 3< / > 4< / > 5< br / > 6 29.134
31.008< / > 38.641< / > 30.775
21.658< / > 27.277 دولار 22.810< / > 24.046< / > 29.324
25.444
18.091
23.364 دولار = C3 / B3 0.783
=C4/B4 0.775
=C5/B5 0.759
=C6 / B6 0.827
=C7 / B7 0.835
=C8/B8 0.857 الحصين نصف الكرة # متوسط شدة التألق Synaptophysin (A.U.) متوسط شدة التألق المحرك (A.U.) نسبة المحرك / Synaptophysin النسبة إلى نصف الكرة الأرضية الوفرة النسبية للمحرك (٪) 1
2< / > 3< / > 4< / > 5< br / > 6 35.26< / > 33.955
41.231< / > 39.853
30.129
28.737 دولار 29.889
27.825< / > 31.978
31.787
27.817
25.861 دولار =C11 / B11 0.848
=C12 / B12 0.819
=C13 / B13 0.776
=C14 / B14 0.798
= C15 / B15 0.923
=C16 / B16 0.900 =D11/D3 1.083
=D12/D4 1.057
=D13 / D5 1.022
=D14/D6 0.965
=D15 / D7 1.105
=د16/د8 1.051 =(E11-1)*100 8.269
=(E12-1)*100 5.673
=(E13-1)*100 2.200
=(E14-1)*100 -3.528
=(E15-1)*100 10.530
=(E16-1)*100 5.064

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.5 مل أنابيب التفاعل إيبندورف 30120094 50 مل أنابيب تفاعل غرينر بيو ون 227261 مولتي ويل 24 بئر فيشر ساينتيك 087721ه ماصة بلاستيكية (يمكن التخلص منها) سارستيدت 8,61,176 ماصة 1000 مل رينين 17014382 ماصة 2 مل إيبندورف 3123000012 دوامة عبقرية 3 إيكا 3340001 شرائح مجهر Menzel فيشر ساينتيك 10144633 ج مجسم لايكا LSM800 زييس مجهر متحد البؤر برنامج تلفزيوني (10X) روش 11666789001 الأنسجة تيك ساكورا 4583 اكتوبر نا₂HPO₄ بيوفروكس 5155 كيلو جرا001 NaH₂PO₄ ميرك 1,06,34,60,500 ريال مصل الماعز العادي ميرك ميليبور S26-100 مل مصل الحمار العادي ميرك S30-100 مل تريتون X-100 ميرك 1,08,60,31,000 أرنب مضاد للمحرك الأنظمة المشبكية RRID: AB_10804285 خنزير غينيا مضاد للسينبتوفيسين الأنظمة المشبكية RRID: AB_1210382 الحمار المضاد للأرانب AF647 جاكسون للأبحاث المناعية RRID: AB_2492288 الماعز المضاد للفأر AF488 جاكسون للأبحاث المناعية RRID: AB_2337438 مويول 4-88 كالبيوكيم 475904 برنامج ZEN2 الأزرق زييس برنامج الفحص المجهري فيجي إيمج جيه برنامج التحليل مايكروسوفت إكسل مايكروسوفت