$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. التجميد السريع وتقسيم الصدر
- قبل البدء في التقسيم ، املأ قارورة ديوار بالنيتروجين السائل مرتديا قفازات واقية من التبريد ونظارات السلامة. احصل على قاطع شفرة ، وشفرات ريشة ، وزوج واحد من الملقط الدقيق ، والثلج ، والمثلج البارد 1x PBS ، والملاقط المبردة.
- قم بإعداد دلو ثلج للحفاظ على 1x PBS باردا مثلج.
- استخدم قاطع الشفرة للإمساك بشفرة الريش بزاوية وثني الشفرة لكسر قطعة صغيرة. يمكن لقاطع الشفرة بعد ذلك قفل الشفرة في موضعها لاستخدامها كمشرط صغير.
ملاحظه: يجب أن تدوم شفرة واحدة لجميع المجموعات. قم بالتبديل إذا انكسرت الشفرة أو أصبحت باهتة.
- أضف طرف ماصة نظيفا إلى P200 وقم بإزالة 1/5 من الطرف لنقل العينات.
- قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق جديد لكل مجموعة وأضف 200 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل أنبوب. سيتم استخدام هذا الأنبوب الثاني لجمع الاستعدادات النهائية ل DLM.
- قم بإزالة كل 1x PBS من الأنابيب باستخدام ماصة باستور.
- ارتداء معدات الحماية المناسبة ، اغمر الأنبوب في قارورة النيتروجين السائل لمدة 10 ثوان باستخدام الملقط المبرد.
ملاحظه: يجب إغلاق الأنابيب بإحكام لمنع الأنبوب من الانفجار.
- قم بإزالة الأنبوب من النيتروجين السائل وأضف ما يقرب من 300 ميكرولتر من 1x PBS المثلج إلى العينات باستخدام ماصة باستور. احتفظ بالعينات على الجليد.
- أضف 1x PBS المثلج إلى طبق التشريح مقاس 10 سم المغطى بالمطاط الصناعي السيليكوني وقم بتوزيع الصدر الأول باستخدام الماصة المعدلة 200 ميكرولتر.
- ضع الجانب البطني الصدري لأعلى. في يد ، استخدم زوجا باهتا من الملقط لوضع الصدر وفي اليد الأخرى استخدم زوجا دقيقا من الملقط لإزالة بعض العقدة الصدرية لفضح خط الوسط للصدر.
- استخدم خط الوسط للصدر كدليل لعمل قطع ضحل من خلال 1/3 من الصدر بالشفرة.
- قم بإزالة الشفرة من الصدر وضع الصدر بزاوية 45 درجة باستخدام ملقط حاد. أعد إدخال الشفرة واقطع خط الوسط للصدر. سيؤدي هذا إلى اثنين من نصفي الصوت.
- خذ نصفي واحد في كل مرة وقم بإزالة الأنسجة الزائدة تحت ألياف العضلات DLM F (الشكل 1 ب) ، وهي الألياف البطنية الأكثر . استخدم الشفرة لعمل قطع أو قطعتين بعناية لإزالة الأنسجة الزائدة دون الإضرار ب DLMs.
- بمجرد عزله ، انقل النصفي إلى الأنبوب الصحيح باستخدام 1x PBS.
- كرر الخطوات 1.6-14.14 حتى يتم عمل 10 تشريح نصفي لكل مجموعة.
< p class = "jove_title" >
2. تلطيخ هيكلي
- بعد تقسيم عينات الصدر إلى نصفين ، ضع الأنسجة في مخزن مؤقت مانع (1x PBS مع 0.1٪ مصل ماعز عادي ، و 0.2٪ Triton X-100 عند درجة الحموضة 7.4) لاختراق الأنسجة ومنع التلوين غير المحدد. استخدم ماصة باستور لإزالة 1x PBS الزائد وإضافة 1.5 مل من المخزن المؤقت للحجب إلى كل أنبوب. انسداد الأنسجة لمدة 1 ساعة على الأقل عند 4 درجات مئوية.
- تحضير العينات للتلوين الهيكلي باستخدام جسم مضاد مترافق فلورسنت ، بيروكسيداز الفجل الحار 488 (مضاد ل HRP-488) عند تخفيف 1: 200 و Phalloidin-647 عند تخفيف 1: 1000 في مانع المخزن المؤقت لتلطيخ الخلايا العصبية الحركية والأنسجة العضلية ، على التوالي. اصنع بقعة كافية للحصول على 150 ميكرولتر لكل أنبوب. قم بتخزين البقعة على حرارة 4 درجات مئوية مغطاة بورق الألمنيوم أو في صندوق مظلم حتى تصبح جاهزة للتلطيخ.
- بعد الحظر ، قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد باستخدام ماصة باستور زجاجية.
- قبل الاستغناء عن البقعة الهيكلية ، قم بتدوير البقعة. أضف 150 ميكرولتر من البقعة إلى كل أنبوب. ضع العينات في صندوق مظلم على الدوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
- قم بإزالة البقعة وغسل المناديل أربع مرات في 1.5 مل من درجة حرارة الغرفة 1x PBS مع 0.3٪ Triton X-100 لمدة 5 دقائق على الدوار في صندوق مظلم. العينات جاهزة الآن للتركيب على شريحة.
< ص الفئة = "jove_title" >
3. تركيب الأنسجة
- بعد غسل العينات في PBST ، قم بإعداد شريحة مجهر لتركيب الأنسجة للتلطيخ. قم بإعداد مستلزمات إضافية بما في ذلك زلات الغطاء الزجاجي ، وماصة P200 ، وأطراف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، والمقص ، والتعزيزات الشفافة ، والملقط ذو الحواف المستقيمة ، ووسائط التثبيت الفلورية المضادة للبهتان ، وطلاء الأظافر ، والصندوق الداكن لتغطية الشرائح.
- قم بتسمية الشريحة لتحديد العينات وتنظيفها بمناديل كيم المبللة لإزالة أي لطخات.
- للتأكد من أن انزلاق الغطاء لا يتلف عينات النصفي ، قم ببناء "جسر" باستخدام ملصقات التعزيز. اقطع ملصق تقوية واحد إلى نصفين وضع كل نصف على بعد 15 مم تقريبا. يجب أن تكون هذه المسافة أصغر من عرض زلة الغطاء. كرر هذه الخطوة أربع مرات لإكمال "جسر" بارتفاع 5 ملصقات.
- خذ الماصة P200 وقم بتعديل طرف عن طريق قطع 1/5 من الطرف لنقل العينات إلى الشريحة. يجب نقل العينات إلى الشريحة الموجودة في وسط الجسر.
- خذ حافة منديل المختبر وقم بإزالة أي PBST زائد. باستخدام الملقط ، رتب DLMs بحيث تواجه جميع العينات جانب العضلات لأعلى وجانب البشرة لأسفل.
- باستخدام طرف ماصة P200 قياسي، ضع 70 ميكرولتر من وسائط التركيب على الشريحة، وتجنب فقاعات الهواء. قم بتوزيع الوسائط في نمط دائري داخل التعزيزات بدءا من الخارج إلى المركز.
- ضع زلة غطاء فوق التعزيزات.
- استخدم طلاء الأظافر لتغطية الحواف الخارجية حول محيط الغطاء. ضعيه بسخاء لتشكيل ختم كامل للأنسجة.
- ضع الشريحة على سطح مستو في الظلام ، مع السماح ب 10 دقائق على الأقل حتى تجف وتمنع التبييض الضوئي أو فقدان التألق. يمكن الآن استخدام الشرائح للتصوير على الفور ، أو تخزينها بطريقة أخرى في مجلد شرائح عند -20 درجة مئوية لعرضها لاحقا.
