التحقيق في إصابة دماغ يرقات الزرد باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني لنقل المسح على نطاق واسع

الملخص

المصدر: Kuipers، J. et al.، المجهر الإلكتروني لنقل المسح الضوئي على نطاق واسع (النانو) لدماغ أسماك الزرد السليمة والمصابة.J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو طريقة للتحقيق في إصابات دماغ يرقات الزرد باستخدام المجهر الإلكتروني لنقل المسح الضوئي على نطاق واسع (STEM) ، وهي تقنية تجمع بين عناصر كل من المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM) لإنتاج صور عالية الدقة. يحدد الخطوات المتبعة في إعداد العينات والحصول على صور العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات عالية الدقة لتحديد إصابات الدماغ.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير العينة

1. التثبيت والتضمين
   1. تثبيت
      1. تخدير يرقات الأسماك في التريكائين (0.003٪) المضافة إلى E3 (5 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي كلوريد كلوريد ، 0.33 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 0.33 ملي مولار MgSO_{4 ،} 10 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.6) ماء الزرد واختبار عمق التخدير عن طريق الوخز برفق باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر تحت مجهر التشريح حتى لا يتم اكتشاف الحركة (الشكل 1 أ).
      2. عند معالجة عينات للفحص المجهري الإلكتروني المترابط (EM) بعد الحصول على بيانات التصوير في الجسم الحي باستخدام التصوير متحد البؤر أو 2 فوتون في 1.8٪ agarose كما هو موضح ، قم بإصلاح اليرقات في الاغاروز باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على Triton-X-100 (0.05٪).
      3. قطع اليرقات من الاغاروز ومعالجتها من أجل EM على نطاق واسع.
      4. قم بإصلاح اليرقات في 4٪ بارافورمالدهيد طازج في PBS الذي يحتوي على Triton-X-100 (0.05٪) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في أنابيب بلاستيكية.
         ملاحظه: يمكن تثبيت الخلايا المزروعة في الثقافة (في المختبر) مباشرة في الجلوتارالديهايد ، كما هو موضح في الخطوة التالية (1.1.1.5).
      5. قم بإزالة المحلول وأضف 100 ميكرولتر 0.5٪ PFA و 2٪ جلوتارالديهايد (GA) و 0.1 M من الكاكوديلات الصوديوم (درجة الحموضة 7.4). يحفظ طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اشطف العينات مرتين في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم.
      6. قطع رؤوس اليرقات بشكل مؤخر إلى الدماغ الخلفي لتسهيل تغلغل الأوزميوم. استخدم محاقن / ملقط ناعم.
      7. يرقات Postfix في 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم (OsO₄) / 1.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم (K₄ [Fe (CN_{) 6}]) في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم على الجليد لمدة ساعتين وشطف 3 × 5 دقائق في H₂O المقطر المزدوج.
      8. يجفف في الإيثانول بمقدار 20 دقيقة من الحضانات في زيادة تركيزات الإيثانول (50٪ ، 70٪ ، 3 مرات 100٪).
   2. تضمين
      1. تحضير راتنجات الايبوكسي وفقا للوصفات القياسية المستخدمة في مختبرات EM.
         ملاحظه: نستخدم راتنجات الايبوكسي على النحو التالي: امزج 19.8 جم من الأثير الجليسيد 100 ، و 9.6 جم من أنهيدريد حمض دوديسينيل السكسينيك ، و 11.4 جم أنهيدريد ميثيل ناديك باستخدام محرك مغناطيسي. أضف 0.5 جم DMP-30 (تريس (ثنائي ميثيل أمينوميثيل) الفينول) واخلطها مرة أخرى.
      2. احتضان اليرقات بين عشية وضحاها في راتنجات الايبوكسي بنسبة 50٪ في الإيثانول (v / v) أثناء الدوران (RT).
      3. استبدل راتنجات الايبوكسي المخففة بالراتنج النقي. احتضن لمدة 30 دقيقة ، أضف الراتنج الطازج مرة أخرى واحتضنه لمدة 30 دقيقة أخرى. مرة أخرى ، قم بتحديث الراتنج ثم احتضانه لمدة 3 ساعات في RT ، متبوعا ب 15 دقيقة عند 58 درجة مئوية و 1 ساعة أخرى عند RT تحت ضغط منخفض (200 ملي بار).
      4. قم بتوجيه الرؤوس في قوالب التضمين المسطحة المصنوعة من السيليكون المتوفرة تجاريا تحت مجهر تشريح باستخدام إبرة أو عود أسنان بحيث يكون الجزء الأمامي مواجها لجانب القالب أو حسب الحاجة (الشكل 1 ب).
      5. بلمرة راتنجات الايبوكسي بين عشية وضحاها عند 58 درجة مئوية. إذا كان راتنجات الايبوكسي لا تزال ناعمة جدا ، اترك يوما آخر للبلمرة والتصلب عند 58 درجة مئوية. إذا ترك هذا بسهولة مسافة بادئة ، اسمح ليوم آخر بالبلمرة والتصلب عند 58 درجة مئوية. عندما تصلب العينة بالكامل ، انتقل إلى التشذيب والتقسيم.
      6. قم بقص الراتنج الزائد من كعب الروتين باستخدام شفرات الحلاقة (الشكل 1 ب).
2. التقسيم والتباين والتركيب
   1. التقسيم
      1. قسم كتلة راتنجات الايبوكسي باستخدام ميكروتومي فائق.
      2. استخدم سكينا زجاجيا أو سكينا بيانيا من الماس لقطع أقسام نصف رفيعة (500 نانومتر) لتلوين التولودين الأزرق / الفوشين الأساسي (الشكل 1 د) لاكتشاف الموضع الصحيح.
      3. انقل الأقسام شبه الرقيقة على شرائح مجهرية عن طريق التقاطها باستخدام ماصة باستور زجاجية تم إغلاق طرفها عن طريق الذوبان في اللهب. يجف على طبق ساخن حتى لا يتبقى الماء. صبغ لمدة 10 ثوان مع 1٪ تولويدين أزرق في الماء على طبق ساخن ، وبعد الشطف بالماء ، قم بالبقعة لمدة 10 ثوان باستخدام 0.05٪ فوكسين أساسي في 1٪ رباعي بورات الصوديوم. افحص بمجهر ضوئي عادي من 10X إلى 40X.
      4. عندما يتم الوصول إلى الموقع / الاتجاه الصحيح داخل الدماغ ، استمر في تقسيم كتلة راتنجات الايبوكسي بسكين ماسي لقطع أقسام رقيقة جدا (~ 70 نانومتر ؛ الشكل 1 هاء)
      5. استخدم الهياكل التشريحية التي يمكن التعرف عليها بسهولة في الدماغ وحوله ، بما في ذلك الحفر الشمية والعينين وحدود المادة الرمادية والبيضاء ، لتحديد منطقة الاهتمام أثناء التقسيم الرقيق للغاية وضبط زاوية التقسيم عند إمالة العينة.
      6. قم بتركيب القسم على فتحة واحدة L2 × 1 شبكات نحاسية (الشكل 1F) ، للسماح بالاستحواذ دون انقطاع بواسطة قضبان الشبكة. استخدم شبكات Formvar المطلية لدعم الأقسام.
   2. المتناقضه
      قم
      1. بتلطيخ الأقسام فائقة النحافة على الشبكات لمدة دقيقتين في أسيتات اليورانيل بنسبة 2٪ في الميثانول متبوعا بسترات رينولدز الرصاص لمدة دقيقتين أخريين.

2. الحصول على الصور

1. الفحص المجهري الإلكتروني لنقل المسح الضوئي على نطاق واسع (STEM)
   ملاحظه: نستخدم مسح EM مع مولد مسح خارجي قادر على الحصول على العديد من مجالات الرؤية الكبيرة بدقة عالية باستخدام اكتشاف STEM. عادة ما تكون صورة واحدة تم إنشاؤها بهذه الطريقة مكافئة لمجالات رؤية ~ 100 صورة مجهر إلكتروني ناقل الحركة (TEM) ، مما يقلل بشكل كبير من كمية الخياطة.
   1. تصاعد العينة في المجهر
      1. ضع الشبكة مع قسم في حامل عينة الشبكة المتعددة وانقلها إلى غرفة SEM.
   2. محاذاة كاشف STEM
      1. ضع الشبكة مع العينة أسفل الحزمة وحركها لأعلى بحيث تكون حوالي 5 مم من عمود العدسة. احصل على صورة عند 20 كيلو فولت باستخدام الكاشف داخل العدسة.
      2. ركز على حافة الشبكة واضبط مسافة العمل على 4.0 مم.
      3. انقل حامل العينة إلى وضع آمن وأحضر كاشف STEM.
      4. قم بتوسيط فتحة كاشف STEM في مجال الصورة عن طريق تدوير براغي الضبط أثناء التصوير بأقصى سرعة باستخدام الكاشف داخل العدسة.
      5. أعد حامل العينة بعناية والذي يتناسب تماما مع عمود العدسة والكاشف.
      6. احصل على صورة باستخدام الكاشف داخل العدسة للتأكد من أنها في منطقة القسم.
      7. قم بالتبديل إلى اكتشاف STEM (متوسط الكسب وجميع الأرباع التي تم تعيينها على "ناقص") ، واحصل على صورة ، وحدد المنطقة المراد مسحها ضوئيا.
      8. ارفع جهد التسارع إلى 21 كيلو فولت وانتظر تثبيت الشعاع (صورة مستقرة مرة أخرى) ، ثم انتقل إلى 29 كيلو فولت بخطوات 2 كيلو فولت.
   3. الحصول على الصور
      1. قم بإشعاع العينة مسبقا (لمنع تغيرات السطوع الناتجة عن الشعاع الإلكتروني) عن طريق التصغير بحيث تناسب المنطقة الكاملة المراد مسحها ضوئيا نافذة الصورة.
      2. قم بتغيير الفتحة إلى 120 ميكرومتر (للحفاظ على النطاق الديناميكي المناسب ، يجب تقليل مكاسب الكاشف بخطوة واحدة).
      3. قم بإلغاء التركيز البؤري حتى تكون الصورة غير واضحة.
      4. اجعل المنطقة الممسوحة ضوئيا ضيقة قدر الإمكان باستخدام خيار مسح المنطقة المنخفضة.
      5. اضبط سرعة المسح الضوئي بحيث يتم مسح الإطار ضوئيا في حوالي 1 - 2 ثانية
         ملاحظه: اعتمادا على الحجم والأنسجة ، يستغرق هذا عادة 1/2 ساعة (مجال رؤية 100 × 100 ميكرومتر (FOV)) إلى ما يصل إلى 3 ساعات (1,000 × 500 ميكرومتر).
      6. قم بالتكبير بمقدار 100X على الأقل وامسح مساحة صغيرة ضوئيا لمدة 10 ثوان.
         ملاحظه: عندما لا تغير هذه المنطقة السطوع مقارنة بمحيطها ، يكون التشعيع المسبق كافيا.
      7. أعد فتحة الفتحة 30 ميكرومتر (وكسب STEM على المتوسط)
      8. ركز على العينة.
      9. قم بمحاذاة فتحة العدسة باستخدام المتذبذب (عند التكبير ~ 40,000X).
      10. أثناء التركيز البؤري ، حدد المنطقة الأخف وزنا / ميزة واضبط سرعة المسح الضوئي بحيث تكون التفاصيل مرئية.
      11. في برنامج المجهر ، اضبط السطوع والتباين من خلال مشاهدة الرسم البياني بعناية للحفاظ على جميع وحدات البكسل في النطاق الديناميكي. افعل الشيء نفسه مع المنطقة / الميزات الأكثر قتامة.
      12. ارجع إلى المنطقة المشرقة وتحقق مرة أخرى. كن في الجانب الآمن بحيث يكون هناك بعض المساحة على جانبي الرسم البياني.
      13. قم بالتصغير بحيث تناسب المنطقة الكاملة المراد مسحها ضوئيا نافذة التصوير وابدأ برنامج الحصول على مساحة كبيرة.
      14. استخدم خيار المعالج لإعداد فسيفساء عن طريق تحديد منطقة من الشاشة. استخدم حجم البكسل 2-5 نانومتر اعتمادا على التفاصيل الضرورية. استخدم وقت السكون 3 ميكرو ثانية ل STEM.
      15. حدد الخيار "التركيز البؤري التلقائي على البلاط السابق" ، واستخدم التركيز التلقائي لبرنامج الاستحواذ على نطاق واسع مع إعدادات الشركة الافتراضية ، وحدد المربع "التحقق من الإعداد قبل التنفيذ" وحدد مكان حفظ البيانات.
      16. اضغط على "تحسين" للتحقق من إعدادات المجهر.
          ملاحظه: الآن ، سيتم عرض الوقت اللازم. قد يصل هذا إلى 72 ساعة لمناطق 1 × 0.5 مم.
      17. في النافذة ، اكتب "الحد الأقصى لدقة البلاط" 20,000 ، لذا لن تكون البلاطات الفردية أكبر من 20 كيلو × 20 كيلو ، مما يمنع تأثيرات الحواف الحادة. اضغط على "تنفيذ".
      18. عندما يطلب منك التحقق من التركيز والسطوع / التباين (B / C) ، قم بإيقاف تشغيل مولد المسح الخارجي واضبط التركيز والاستجماتيزم بعناية في برنامج المجهر. لا تقم بتغيير B / C.
          ملاحظه: يمكن تحريك المرحلة وتغيير التكبير ، ولكن يجب إعادة التكبير إلى حجم البكسل المطلوب.
      19. قم بتشغيل مولد المسح الخارجي مرة أخرى واضغط على "متابعة".

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: سير عمل المجهر الإلكتروني للأنسجة على نطاق واسع على أدمغة أسماك الزرد. (أ)يرقات الزرد البالغة من العمر 7 أيام. (ب) رؤوس يرقات الزرد مدمجة جنبا إلى جنب في راتنجات الايبوكسي. (ج) سكين زجاجي للتقسيم شبه الرقيق وتوجيه العينة. (د) قسم ممثل شبه رقيق ملطخ باللون الأزرق تولويدين يظهر يرقتين من يرقات الزرد المضمنة جنبا إلى جنب. (ه...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المواد الكيميائيه انخفاض نقطة الانصهار الاغاروز VWR 444152 جرام تركايين سيغما [إ10521] تريتون- X-100 سيغما X100 الجلوتارالديهايد العلوم المتعددة 1909 كاكوديلات الصوديوم سيغما سي 0250 أوسميومتيتروكسيد علوم المجهر الإلكتروني 19114 فيروسيانيد البوتاسيوم (K4 [Fe (CN)] 6) ميرك 4984 ايثانول VWR 20821.365 أسيتات اليورانيل ميرك 8473 الصوديوم تترابورات ميرك 1063808 تولدويدين الأزرق ميرك 1273 فوشين أساسي BDH 340324 سترات الرصاص BDH توقف إيبون 2-دوديسينيل سوكسينيك سكري أنهيدريد سيرفا هاتف 20755 أنهيدريد ميثيل ناديك سيرفا هاتف: 29452 الأثير الجليسيد 100 سيرفا هاتف 21045 DMP-30 العلوم المتعددة 553 قالب تضمين مسطح قياسي علوم المجهر الإلكتروني 70901 سكين الماس شركة دياتوم شبكات نحاسية علوم المجهر الإلكتروني شريط كربون مزدوج الوجهين علوم المجهر الإلكتروني مسح EM Zeiss Supra55 زييس ultramicrotome Leica EM UC7 لايكا مولد المسح الخارجي أطلس فيبيكس