مقالة منهجية

تمايز ونضج الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى عضيات عصبية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Cosset ، E. ، وآخرون. العضيات العصبية البشرية لدراسة سرطان الدماغ والأمراض التنكسية العصبية. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، يتم عرض بروتوكول تدريجي للخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى عضيات عصبية. تتضمن الطريقة تحفيز تكوين وردة عصبية ، متبوعا بالنضج المتحكم فيه والثقافة النهائية على غشاء كاره للماء لتحقيق عضيات عصبية متطورة بالكامل.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. صيانة واستزراع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية غير المتمايزة (hESCs)

  1. قم بإجراء صيانة وتوسيع hSECs في ظروف خالية من المغذيات عن طريق الطلاء المسبق للأطباق بمصفوفة محددة خارج الخلية.
    1. قم بإذابة 300 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية عند 4 درجات مئوية (تركيز النطاق النموذجي 18-22 مجم / مل ، حافظ على الثلج) واخلطه برفق مع 15 مل من DMEM البارد (Dulbecco's Modified Eagle Medium) لتجنب التبلور المبكر للمصفوفة خارج الخلية. أضف 7.5 مل من المصفوفة خارج الخلية إلى كل من قارورة T150.
    2. احتضان الأطباق المغلفة بمصفوفة خارج الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل (بحد أقصى طوال الليل).
    3. قم بإزالة hESCs المتوسطة والبذور بكثافة 6.5 × 104 خلية / سم2.
  2. الحفاظ على H1 (خط خلايا hESC) في وسط hESC و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
  3. مرر الخلايا بإجراء إنزيمي: أضف 7.5 مل من المحلول الأنزيمي إلى قارورة T75 سم 2 على مدى 1-2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بمجرد فصل الخلايا تماما ، أضف 7.5 مل من DMEM-F12 ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. للسماح ببقاء أفضل ، أعد صفيحة الخلايا بالكثافة المطلوبة على أطباق مغلفة بمصفوفة خارج الخلية ، في نفس الوسط الذي يحتوي على مثبط بروتين كيناز (ROCK) المرتبط ب Rho (10 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة.
فئة

2. العضيات العصبية المشتقة من hESC

  1. قبل 24 ساعة من بدء الثقافة ثلاثية الأبعاد ، استبدل وسط hESC بوسط خال من المصل مكمل بمثبط 10 ميكرومتر ROCK (كلا المكونين ضروريان لدعم بقاء الخلية وتكوين الغلاف العصبي التلقائي أثناء مرحلة التجميع في صفيحة ميكروويل). يجب أن تكون الخلايا عند التقاء 60٪. في اليوم التالي (اليوم 0) ، افصل مستعمرات hESC كخلايا مفردة: قم بإزالة الوسط ، واشطفه باستخدام PBS بدون Ca2 + / Mg2+ ، وأضف 5 مل من محلول الذوبان الأنزيمي ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة.
  2. اجمع الخلايا في وسط خال من المصل مكملا ب 10 ميكرومتر من مثبطات ROCK وقم بطردها عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وعد الخلايا في 10 مل من الوسط الخالي من المصل المكمل ب 10 ميكرومتر من مثبط ROCK.
  3. في موازاة ذلك ، اشطف لوحة microwell ب 2 مل من الوسط الخالي من المصل لكل بئر وقم بالطرد المركزي للوحة عند 1200 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة جميع الفقاعات ، والتي يمكن أن تمنع تكوين الغلاف العصبي.
  4. تحضير 28.2 × 106 خلايا في 12.5 مل من الوسط الخالي من المصل المكمل بمثبط 10 ميكرومتر من الصخور. توزيع 1000 خلية / ميكروويل. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية طوال الليل (36 ساعة كحد أقصى). على سبيل المثال ، للحصول على 30 عضوية عصبية بشرية ، استخدم قارورة T150 واحدة عند 70٪ -80٪ من التقاء (حوالي 30 مليون خلية).
  5. في اليوم التالي (اليوم 1) ، اجمع الكرات (مع P1000) وضعها في طبق 6 آبار. في كل بئر ، أضف 2 مل من وسط B27 و DMEM-F12 GlutaMAX والوسط العصبي القاعدي (امزج بنسبة 1: 1) ، مع استكمال 1٪ من مكملات B27 و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA). لتعزيز الحث العصبي السريع ، استكمل الوسط بكوكتيل تثبيط مزدوج SMAD (Sma و Mad Related Protein) يتكون من 10 ميكرومتر TGFβ (عامل النمو المحول بيتا) / Activin / مثبط عقدة ومثبط البروتين المورفوجينيك للعظم (BMP) 0.5 ميكرومتر. من هذه الخطوة إلى الأمام ، يتم استزراع الكرات في دوران (60 دورة في الدقيقة ، شاكر مداري). يعد الدوران أمرا بالغ الأهمية لمنع الكرات من الالتصاق ببعضها البعض أو باللوحة.
  6. قم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام: ثني اللوحة واترك الكرات تسقط لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة نصف الوسط (2 مل) ، وأضف 2 مل من وسط B27 الطازج المكمل بعوامل النمو والمثبطات. لا تقم بالطرد المركزي للكرات.
  7. إجراء الحث العصبي وفقا للدورة الزمنية التالية:
    1. من الأيام 1-4 ، استزراع المجالات في وسط B27 مكمل ب SMAD المزدوج. يعزز كوكتيل تثبيط SMAD المزدوج (10 ميكرومتر TGFβ / Activin / مثبط عقدي ومثبط BMP 0.5 ميكرومتر) الحث العصبي.
    2. من الأيام 4-11 ، عزز تكاثر الوريدات العصبية المشتقة من hESC (في المجالات) ، عن طريق إضافة 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) و 10 نانوغرام / مل عامل الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) إلى وسط B27 المكمل بكوكتيل SMAD المزدوج.
      ملاحظه: في اليوم 11 ، يجب أن تكون معظم الخلايا إيجابية ل Nestin.
    3. من الأيام 11-13 ، استزراع الكرات في وسط B27 مكملا بمثبط BMP 0.5 ميكرومتر.
    4. من الأيام 13-21 ، استزراع المجالات في وسط B27 مكملا ب 10 نانوغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من الدبقي (GDNF) ، و 10 نانوغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) و 1 ميكرومتر من مثبط γ-سيكريتاز. يعزز GDNF و BDNF التمايز العصبي والدبقي. يسمح مثبط γ-secretase بمزيد من النضج العصبي.
    5. في اليوم 21 ، قم بوضع الكرات (حوالي 1,000 كرة) على غشاء بولي تترافلورو إيثيلين محب للماء (PTFE) (قطر 6 مم ، 0.4 ميكرومتر) مودع على إدراج لوحة ثقافة مصممة ل 6 ألواح آبار. أوقف أي دوران من هذه الخطوة. يشير وجود الوريدات ، التي لوحظت بمجهر المجال الساطع ، إلى بدء التمايز العصبي. يمكن ملاحظة الوريدات العصبية بعد 2-3 أيام من طلاء الكرات على غشاء PTFE.
    6. أضف 1 مل من وسط B27 المكمل بعوامل النمو والمثبطات (على النحو التالي) إلى كل بئر أسفل ملحق الغشاء ، كل 2-3 أيام (عادة أيام الاثنين والأربعاء والجمعة) ، لمدة 3 أسابيع من التمايز التالية.
    7. من الأيام 21-25 ، قم بزراعة العضيات العصبية البشرية في نفس وسط النضج العصبي.
    8. من الأيام 25-28 ، استكمل فقط وسط B27 بمثبط γ سيكريتاز 1 ميكرومتر.
    9. من الأيام 28-39 ، توقف عن إضافة مثبط γ-secretase واستمر في زراعة العضوية العصبية البشرية في وسط B27 فقط.
      ملاحظه: بعد 3 أسابيع ، تصبح العضيات العصبية جاهزة للاستخدام في زرع GIC. على طول النضج العصبي ، لوحظ انخفاض في العلامة العصبية غير الناضجة Nestin وزيادة في العلامات العصبية الناضجة β3-tubulin و GFAP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات لوحة 6 آبار (لوحة 6 آبار) فالكون / كورنينج 07-201-588 Aggrewell 400 (لوحات استزراع Microwell) تقنيات الخلايا الجذعية 34421 مكملات B27 (B27) تقنيات الحياة / Invitrogen 1238 لكلا البروتوكولين ، حل المخزون 100x ، الحل النهائي 1x عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) توجيه الخلية جي إف إتش 1-2 لكلا البروتوكولين ، محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل في H2O النقي ، محلول نهائي 20 نانوغرام / مل المركب E مثبط γ-سيكريتاز (مثبط γ-سيكريتايز) كالبيوكيم 209986-17-4 لكلا البروتوكولين (مثبط جاما سيكريتيز الحادي والعشرون) ، محلول المخزون 5 ملي مولار في DMSO ، الحل النهائي 1 ميكرومتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد نقي (DMSO) سيجما ألدريتش ج 6164 مركبات المذيبات ، جاهزة للاستخدام وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) تقنيات الحياة هاتف: 12491-015 لزراعة الخلايا ، جاهز للاستخدام خليط النسر المتوسط المعدل F-12 من Dulbecco (DMEM-F12) جيبكو 11320033 لزراعة الخلايا ، جاهز للاستخدام EDTA 0.1 ملي (EDTA) تقنيات الحياة AM9912 لزراعة الخلايا ، جاهز للاستخدام عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية (GDNF) توجيه الخلية جي إف إتش 2-2 لكلا البروتوكولين ، محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل في H2O النقي ، محلول نهائي 20 نانوغرام / مل غشاء بولي تترافلورو إيثيلين محب للماء (غشاء PTFE) واجهة BioCell توقف LDN-193189 (مثبط BMP) أكسون ميدشيم / ستيمجن 04-0072-02 /1509 مزدوج / SMAD ، محلول مخزون 5 ملي مولار في DMSO ، الحل النهائي 0.5 ميكرومتر ل-جلوتامين (L-جلوتامين) جيبكو 25030081 L-Glutamine (200 ملم) ، محلول مخزون 200 ملم ، محلول نهائي 2 ملي Matrigel (مصفوفة خارج الخلية) BD Biosciences 354277 مصفوفة مؤهلة من hESC ، محلول مخزون 18-22 مجم / مل ، محلول نهائي 180-220 ميكروغرام / مل إدراج لوحة ثقافة Millicell-CM (0.4 ميكرومتر) (إدراج لوحة الثقافة) ميليبور PICM03050 الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة β-Tubulin III سيغما تي 8660 1/1000 تخفيف شاكر MS المداري، MS-NOR-30 (شاكر مداري) العلوم الرئيسية MS-NRC-30 العصبي العصبي (العصبي العصبي) لايف تكنولوجيز / جيبكو 21103049 صيانة ونضج مجموعات الخلايا العصبية الجنينية ، جاهزة للاستخدام الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) جيبكو 11140 الأحماض الأمينية غير الأساسية 100X ، محلول المخزون 100x ، الحل النهائي 1x الأجسام المضادة Nurr1 (M-196) سانتا كروز SC-5568 1/100 تخفيف التغذية (وسط hESC) الصناعات البيولوجية 05-100-1 أ وسائط الخلايا الجذعية ، جاهزة للاستخدام البنسيلين / الستربتومايسين (البنسيلين / الستربتومايسين) لايف تكنولوجيز / جيبكو 15140122 لزراعة الخلايا ، محلول المخزون 5 مجم / مل ، المحلول النهائي 50 ميكروغرام / مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون Ca2 + / Mg2 + (PBS بدون Ca2 + / Mg2 +) تقنيات الحياة 14190250 لزراعة الخلايا ، جاهز للاستخدام كيناز Y-27632 المرتبط ب Rho (ROCK) Abcam Biochemicals AB120129-1 مثبط الصخور ، محلول مخزون 50 ملي مولار في DMSO ، الحل النهائي 10 ميكرومتر SB-431542 (مثبط TGFβ / Activin / Nodal) تحليق آسك- 163 Dual-Smad، محلول مخزون 50 ملي مولار في DMSO، محلول نهائي 10 ميكرومتر StemPro Accutase (محلول إنزيمي hESC) جيبكو أ11105-01 حل إنزيمي hESC جاهز للاستخدام قارورة T150 (قارورة T150) صقر 08-772-1F تحويل عوامل النمو بيتا 3 (TGFβ3) توجيه الخلية جي إف إتش 109-2 بالنسبة لبروتوكول الدوبامين ، محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل في الإيثانول النقي ، المحلول النهائي 1 نانوغرام / مل التربسين 0.25٪ (محلول إنزيمي) تقنيات الحياة 15050065 محلول إنزيمي جاهز للاستخدام X-vivo (وسط خال من السيروم) لونزا BE04-743Q وسط خال من السيروم ، جاهز لك

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SMAD

مقالات ذات صلة