توليد العضيات العصبية الدوبامينية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

الملخص

المصدر: Cosset، E. et al. العضيات العصبية البشرية لدراسة سرطان الدماغ والأمراض التنكسية العصبية. J. Vis. إكسب. (2019)

يوضح هذا الفيديو تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى خلايا عصبية الدوبامين ، لتقديم نموذج لدراسة مرض باركنسون. يتم استزراع hESCs في وسط تحريض عصبي في صفيحة ميكروويل لتشكيل مجالات عصبية ثلاثية الأبعاد. ثم يتم استزراعها في وسط الحث العصبي لتعزيز التمايز إلى الخلايا العصبية السلفية الدوبامينية. يحدث النضج النهائي للخلايا العصبية في إدراج الثقافة في ظل ظروف واجهة الهواء والسائل ، مما ينتج عنه عضيات ثلاثية الأبعاد تتكون من خلايا عصبية دوبامين ناضجة.

البروتوكول

فئة < p = "jove_title" >1. العضيات الدوبامين المشتقة من hESC لدراسات مرض باركنسون (PD)

1. اليوم 0: تضخيم hESCs في مزرعة ثنائية الأبعاد تصل إلى 60٪ من التقاء (اليوم 0) ، ثم استبدل وسائط الخلايا الجذعية المستخدمة للحفاظ على ميزات تعدد القدرات في hESCs بوسط خال من المصل. ابدأ الحث العصبي عن طريق استكمال وسط الاستزراع بمثبط البروتين المورفوجيني للعظم (BMP) 0.5 ميكرومتر وبيتا عامل النمو المحول 10 ميكرومتر (TGFβ) / Activin / مثبط عقدة (كوكتيل تثبيط SMAD المزدوج) ، ثم أضف 10 ميكرومتر مثبط بروتين كيناز مرتبط ب Rho (ROCK) لمدة 24 ساعة لزيادة معدل بقاء الخلايا أثناء المرور.
2. اليوم 1: تحضير صفيحة الميكروويل بسعة 2.5 مل لكل بئر من الوسط الخالي من المصل مع مثبط BMP 0.5 ميكرومتر ، و 10 ميكرومتر TGFβ / Activin / مثبط عقدة ، و 10 ميكرومتر مثبط ROCK. لتحديد الخلايا باتجاه النمط البطني للأنبوب العصبي ، أضف 100 نانوغرام / مل من القنفذ الصوتي (SHH) ، و 100 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية 8 (FGF8) ، و 2 ميكرومتر ناهض ممنع. قم بالطرد المركزي للوحة (فقط مع خلايا متوسطة وبدون خلايا) عند 1200 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة فقاعات الهواء من الآبار الصغيرة.
   1. بعد يوم واحد من الحث العصبي في 2D ، قم بإزالة الوسط واغسله بسرعة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون Ca^{2 +} / MgCl²⁺. قم بفصل المستعمرات في تعليق الخلايا المفردة عن طريق إضافة 7.5 مل من المحلول الأنزيمي المؤتلف في قارورة T75 سم². احتضن لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية ثم أكمل ب 7.5 مل من خليط النسر المتوسط / المغذي المعدل من Dulbecco F-12 (DMEM-F12).
   2. اجمع معلق الخلية وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وعد الخلايا في نفس الوسط المستخدم لتحضير لوحة الميكروبئر.
   3. اضبط الحجم المتوسط للحصول على تعليق خلوي يسمح بتكوين مجالات عصبية تحتوي على 1000 خلية لكل ميكروبئر (على سبيل المثال ، تحتوي لوحة microwell المستخدمة هنا على 4,700 ميكروبئر لكل بئر). لذلك ، قم بإعداد 4.7 مليون خلية في 2.5 مل من الوسط وأضفها إلى 2.5 مل من الوسط السابق الموضوع بالفعل في الطبق.
   4. لتوزيع الخلايا بشكل صحيح في كل بئر صغير ، قم بهز اللوحة برفق ، وقم بالطرد المركزي للوحة microwell 300 × g لمدة 5 دقائق.
3. اليوم 2: اغسل الآبار الصغيرة برفق بالوسط واجمع ثم انقل الكرات في صفيحة من ستة آبار معالجة بالأنسجة. استبدل الوسط بوسط عصبي قاعدي مكمل بنسبة 1٪ B27 ، و 1x من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، و 2 ملي مولار L-glutamine ، و 1٪ من البنسلين / الستربتومايسين. بالإضافة إلى ذلك ، أضف عوامل الإقليم SHH و FGF8 والناهض المنعم والجزيئات الصغيرة لتثبيط SMAD المزدوج.
   1. ضع الكرات في دوران عند 37 درجة مئوية (60 دورة في الدقيقة ، شاكر مداري) وقم بتغيير نصف متوسط مكمل طازجا كل 2-3 أيام.
4. اليوم 3: لتعزيز الحث العصبي والتحويل إلى أسلاف عصبية ذات هوية الدماغ المتوسط ، استكمل الوسط بمثبط 3 ميكرومتر من الجليكوجين سينسيز كيناز -3 بيتا (GSK-3β) ، والذي ينشط مسار Wnt / β-catenin. حافظ على مثبط GSK-3β في الوسط حتى اليوم 13. قم بتقسيمها إلى لوحين جديدين من 6 ألواح آبار معالجة بالأنسجة لتقليل كثافة الكرة لكل بئر وتجنب تراكم الكرة.
   ملاحظه: في اليوم الثامن ، يجب أن تكون معظم الخلايا إيجابية ل Nestin.
5. اليوم 8: بدء النضج العصبي: استبدل عوامل الإقليم SHH و FGF8 وناهض ممنع وكوكتيل تثبيط SMAD المزدوج ب 0.5 ملي مولار ثنائي بوتيريل أحادي الفوسفات الدوري الأدينوزين (cAMP) (لصالح النضج) ، مثبط 20 نانومتر من هيستون ديستيلاز (للخروج من دورة الخلية) ، 1 ميكرومتر مثبط γ-سيكريتاز وعوامل النمو ، 10 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) ، 10 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) ، و 1 نانوغرام / مل عامل النمو المحول β3 (TGFβ3) ، و 5 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية 20 (FGF20) (كلاهما يفضل بقاء السلف الدوبامين [DA]). قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام.
6. اليوم 21: توليد العضوية العصبية: زرع حوالي 100 مجال عصبي في ظل ظروف واجهة الهواء والسائل على بولي تترافلورو إيثيلين (غشاء PTFE ، قطر 6 مم). انقل الغشاء إلى إدراج لوحة الثقافة (0.4 مم) وأضف 1.2 مل من وسط النضج العصبي المستخدم لتمايز الغلاف العصبي كما هو موضح سابقا.
   1. أوقف أي دوران من هذه الخطوة. قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام حتى يتم تحقيق النقطة الزمنية المطلوبة للتمييز.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات لوحة 6 آبار (لوحة 6 آبار) فالكون / كورنينج 07-201-588 Aggrewell 400 (لوحات استزراع Microwell) تقنيات الخلايا الجذعية 34421 مكملات B27 (B27) تقنيات الحياة / Invitrogen 1238 لكلا البروتوكولين ، حل المخزون 100x ، الحل النهائي 1x عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) توجيه الخلية جي إف إتش 1-2 لكلا البروتوكولين ، محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل في H2O النقي ، محلول نهائي 20 نانوغرام / مل CHIR-99021 (مثبط GSK-3β) أكسون ميدكيم CT99021 بالنسبة لبروتوكول الدوبامين، محلول المخزون 7.5 ملي مولار في DMSO، الحل النهائي 3 ميكرومتر المركب E مثبط γ-سيكريتاز (مثبط γ-سيكريتايز) كالبيوكيم 209986-17-4 لكل من البروتوكولين (مثبط جاما سيكريتيز الحادي والعشرون) ، محلول المخزون 5 ملي مولار في DMSO ، الحل النهائي 1 ميكرومتر ديبوتيريل دوري AMP (ديبوتيريل كامبر) سيغما د0627 لبروتوكول الدوبامين، محلول المخزون 0.5 م في DMSO، الحل النهائي 0.5 ملي مولار خليط النسر المتوسط المعدل F-12 من Dulbecco (DMEM-F12) جيبكو 11320033 لزراعة الخلايا ، جاهز للاستخدام EDTA 0.1 ملي (EDTA) تقنيات الحياة AM9912 لزراعة الخلايا ، جاهز للاستخدام عامل نمو الخلايا الليفية 20 (FGF20) بيبروتك 100-41 بالنسبة لبروتوكول الدوبامين ، محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل في H2O النقي ، محلول نهائي 5 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية 8 (FGF8) بيبروتك GFH176-5 بالنسبة لبروتوكول الدوبامين ، محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل في H2O النقي ، محلول نهائي 100 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من الخلايا الدبقية (GDNF) توجيه الخلية جي إف إتش 2-2 لكلا البروتوكولين ، محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل في H2O النقي ، محلول نهائي 20 نانوغرام / مل غشاء بولي تترافلورو إيثيلين محب للماء (غشاء PTFE) واجهة BioCell توقف LDN-193189 (مثبط BMP) أكسون ميدشيم / ستيمجن 04-0072-02 /1509 مزدوج / SMAD ، محلول مخزون 5 ملي مولار في DMSO ، الحل النهائي 0.5 ميكرومتر ل-جلوتامين (L-جلوتامين) جيبكو 25030081 L-Glutamine (200 ملم) ، محلول مخزون 200 ملم ، محلول نهائي 2 ملي إدراج لوحة ثقافة Millicell-CM (0.4 ميكرومتر) (إدراج لوحة الثقافة) ميليبور PICM03050 شاكر MS المداري، MS-NOR-30 (شاكر مداري) العلوم الرئيسية MS-NRC-30 مكملات N2 (N2) إنفيتروجين 17502-048 لثقافة GIC ، حل المخزون 100x ، الحل النهائي 1x العصبي العصبي (العصبي العصبي) لايف تكنولوجيز / جيبكو 21103049 صيانة ونضج مجموعات الخلايا العصبية الجنينية ، جاهزة للاستخدام الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) جيبكو 11140 الأحماض الأمينية غير الأساسية 100X ، محلول المخزون 100x ، الحل النهائي 1x التغذية (وسط hESC) الصناعات البيولوجية 05-100-1 أ وسائط الخلايا الجذعية ، جاهزة للاستخدام البنسيلين / الستربتومايسين (البنسيلين / الستربتومايسين) لايف تكنولوجيز / جيبكو 15140122 لزراعة الخلايا ، محلول المخزون 5 مجم / مل ، المحلول النهائي 50 ميكروغرام / مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون Ca2 + / Mg2 + (PBS بدون Ca2 + / Mg2 +) تقنيات الحياة 14190250 لزراعة الخلايا ، جاهز للاستخدام بورمورفامين (ناهض ناعم) كالبيوكيم SML0868 بالنسبة لبروتوكول الدوبامين ، محلول مخزون 10 ملي مولار في DMSO ، الحل النهائي 2 ميكرومتر كيناز Y-27632 المرتبط ب Rho (ROCK) Abcam Biochemicals AB120129-1 مثبط الصخور ، محلول مخزون 50 ملي مولار في DMSO ، الحل النهائي 10 ميكرومتر SB-431542 (مثبط TGFβ / Activin / Nodal) تحليق آسك- 163 Dual-Smad، محلول مخزون 50 ملي مولار في DMSO، محلول نهائي 10 ميكرومتر سونيك القنفذ (SHH) توجيه الخلية جي إف إتش 168-5 بالنسبة لبروتوكول الدوبامين ، محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل في H2O النقي ، محلول نهائي 100 نانوغرام / مل StemPro Accutase (محلول إنزيمي hESC) جيبكو أ11105-01 حل إنزيمي hESC جاهز للاستخدام قارورة T150 (قارورة T150) صقر 08-772-1F تحويل عوامل النمو بيتا 3 (TGFβ3) توجيه الخلية جي إف إتش 109-2 بالنسبة لبروتوكول الدوبامين ، محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل في الإيثانول النقي ، المحلول النهائي 1 نانوغرام / مل Trichostatine A (مثبط هيستون ديستيلاز) سيغما تي 8552 بالنسبة لبروتوكول الدوبامين، محلول المخزون 100 ميكرومتر في DMSO، الحل النهائي 20 نانومتر TrypLE (محلول إنزيمي مؤتلف) إنفيتروجين 12604021 محلول إنزيمي مؤتلف ، جاهز للاستخدام التربسين 0.25٪ (محلول إنزيمي) تقنيات الحياة 15050065 محلول إنزيمي جاهز للاستخدام X-vivo (وسط خال من السيروم) لونزا BE04-743Q وسط خال من السيروم ، جاهز للاستخدام