نمذجة النزيف الناجم عن المخدرات في يرقات الزرد

الملخص

المصدر: Crilly، S.، et al. استخدام يرقات الزرد لدراسة العواقب المرضية للسكتة الدماغية النزفية. J. Vis. إكسب. (2019)

في هذا الفيديو ، يتم تفكيك أجنة الزرد المخصبة تحت مجهر استريو ثم تعرضها لمثبط تخليق الكوليسترول ، مما يؤدي إلى تطور تمزق الأوعية الدموية ونزيف الدماغ في اليرقات. يتم بعد ذلك فصل اليرقات النزفية ، التي يمكن التعرف عليها بواسطة بقع حمراء مميزة ، تحت المجهر لمزيد من التحليل.

البروتوكول

ملاحظة: تشمل الخطوط المعدلة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسة النسب الخاص بالبلاعم mpeg1: mCherry (تم إنشاؤه داخليا) ، mpo الخاص بالعدلات: GFP ، gata1: dsRed و ubiq: secAnnexinV-mVenus ، مراسل لموت الخلايا (أعيد اشتقاقه في المنزل) على خلفيات من النوع البري ، الصدف (MITfa^{W2 / W2}) وطافرة (BBH^M292).

< p class = "jove_title" >1. اليوم 0: إنتاج البيض وجمعه

1. اجمع الأجنة المخصبة من التفريخ الطبيعي في صناديق التكاثر المنتجة من 1 ذكر و 1-2 أنثى من أسماك الزرد البالغة.
   ملاحظه: بالنسبة لبروتوكول أتورفاستاتين ، يمكن استخدام أي من النوع البري / المعدلة وراثيا. ومع ذلك ، تختلف معدلات النزيف قليلا بين السلالات.
2. احتضان 100 جنين عند 28 درجة مئوية في وسط الجنين E3 القياسي لكل طبق بتري والمرحلة وفقا للإرشادات القياسية.
3. في ~ 6 ساعات بعد الإخصاب (HPF) ، قم بإزالة الأجنة الميتة وغير المخصبة من الطبق باستخدام ماصة باستور. يوضح الشكل 1 الجدول الزمني التجريبي.

2. اليوم 1: علاج أتورفاستاتين بقوة 24 حصان

1. أجنة مزيل الكشية لعلاج أتورفاستاتين باستخدام ملقط تشريح حاد ورفيع للغاية. يمكن تعديل الأرقام المطلوبة للتجريب وفقا لذلك.
2. أضف 30 مل من وسط الجنين E3 إلى طبقين نظيفين من بتري. استخدم طبقا واحدا ل 100 جنين.
   ملاحظه: إذا كانت الصفائح مصممة لزراعة الخلايا ، فغالبا ما تلتصق أسماك الزرد المنزوعة الغضب في هذه المرحلة المبكرة بالقاع. لتجنب ذلك ، اشطف الأطباق جيدا بالماء النظيف قبل الاستخدام.
3. قم بإزالة 60 ميكرولتر من ماء الجنين من لوحة المعالجة وأضف 60 ميكرولتر من 0.5 ملي مولار أتورفاستاتين (ATV). عند تركيز مخزون 0.5 ملي مولار ، سيؤدي التخفيف أعلاه إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر ، مما ينتج عنه ~ 20٪ من اليرقات غير النزفية (ICH-) و ~ 80٪ من نزيف اليرقات (ICH +). استخدم اللوحة الأخرى للضوابط غير المعالجة.
   ملاحظه: يذوب أتورفاستاتين في الماء المقطر (3 مجم إلى 10 مل) لصنع محلول مخزون 0.5 مل. احتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع التحريض لأن الذوبان يستغرق بعض الوقت. يمكن أن يستغرق الذوبان الكامل ما يصل إلى 1 أسبوع. لا تستخدم DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد). يتم نقل المحلول وتخزينه عند -20 درجة مئوية. لا تجمد وتذوب.
4. باستخدام ماصة باستور، انقل 100 جنين في أقل قدر ممكن من الماء إلى ألواح المعالجة.
5. احتضان الألواح عند 28 درجة مئوية
   ملاحظه: ICH (نزيف داخل المخ) سيحدث بين 33 و 48 HPF. لا يحتاج أتورفاستاتين إلى الإزالة لأن الحضانة التي تزيد عن 24 ساعة لا تسبب أي مشاكل أخرى في النمو.

3. اليوم 2: فصل مجموعات ICH و ICH + عند 50 hpf

1. افصل أسماك ICH + عن مجموعات ICH وانقلها إلى أطباق جديدة لسهولة السهولة.
   1. إذا كنت تستخدم نموذج ATV بتركيز 1 ميكرومتر ، فإن 75-100٪ من اليرقات ستظهر نزيفا (ICH +) في هذه المرحلة الزمنية.
      ملاحظه: تختلف استجابة اليرقات بين السلالات ، إذا لم تنزف اليرقات بالترددات المرغوبة ، فاستخدم دفعة جديدة من أتورفاستاتين أو تركيز أعلى. إذا لم تظهر اليرقات نزيفا بمقدار 48 hpf ، فاعتبرها ICH-.
   2. في حالة استخدام نموذج bbh ، فإن جميع الطفرات متماثلة اللواقح ستظهر نزيفا بمقدار 48 حصان. في حالة استخدام الصليب المتغاير الزيجوت ، يمكن استخدام الأشقاء من النوع المتغاير الزيجوت والبرية كحيوانات تحكم للتجارب.
2. إذا لزم الأمر ، قم بتخدير اليرقات بإضافة 0.02٪ MS222 إلى وسائط E3. باستخدام ماصة باستور ، قم بفرز اليرقات لوجود الدم في الرأس إلى وسائط E3 جديدة. انظر الشكل 2.
   ملاحظه: قد يظهر الدم في الرأس في الدماغ الأمامي أو الأوسط أو الخلفي أو مجتمعة ، ويمكن أن يختلف حجم النزيف بين. في طفرات bbh ، غالبا ما يرتبط التراث الثقافي غير المادي بالوذمة الشديدة ، والتي يمكن التعرف عليها من خلال رؤوس أكبر ، ومسافة أوسع بين العينين ، ونزيف أكثر انتشارا. ومع ذلك ، لا تظهر جميع يرقات ICH + bbh وذمة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: رسم بياني للجدول الزمني التجريبي لتوصيف إصابات الدماغ والنتائج الحركية والالتهابات العصبية. ICH, نزيف داخل المخ; BBH ، رأس الفقاعة.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: ICH + الأنماط الظاهرية لنزيف الدماغ. أمثلة على الأنماط الظاهرية لليرقات ICH الت...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 24 لوحة بئر سيجما ألدريتش CLS3527 حاضنة 28 درجة مئوية نظام إدارة التعلم 210 أتورفاستاتين سيجما ألدريتش PZ0001-5 ملغ صناديق التربية أنظمة ثورين المائية 10011 غرفة مراقبة Daniovision نولدوس غير متاح E3 متوسط 1x 4٪ محيط فوري ، 500 ميكرولتر أزرق ميثيلين في 1 لتر dH2O برنامج EthoVision XT نولدوس الإصدار 11 محيط فوري المحيط الفوري SS15-10 مجهر لايكا MZ95 مجهر تشريح ماصة P1000 جيلسون F144059M أطراف ماصة P1000 ستارلاب S1122-1830 ماصات باستور ستارلاب E1414-0300 أطباق بتري كورنينج 101 في آر 20 Pipetboy Integra Biosciences بيبيتبوي ملقط تشريح فائق الدقة أجار العلمية AGT502 برنامج Zen زييس الإصدار 2.3