تلطيخ الفلورسنت المناعي للبروتينات السكرية في الخلايا السلفية العصبية والخلايا العصبية

الملخص

المصدر: Bai، Q.، et al.، تحديد علامات سطح الخلية للخلايا الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلفية عن طريق وضع العلامات الأيضية على Sialoglycan. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو البيوتينيل ووضع العلامات الفلورية للبروتينات السكرية السلية المعدلة في الخلايا الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلفية ، وكذلك الخلايا العصبية ، وتصورها باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تلطيخ الفلورسنت المناعي للبروتينات السكرية في NSPCs الأولية الموسعة والخلايا العصبية المتمايزة

1. تحضير مركب BTTAA-CuSO₄ 1 30x يحتوي على 1.5 ملي مولار CuSO₄ و 9 ملي مولار BTTAA في ماء مقطر مزدوج. قم بإعداد المخزن المؤقت المترافق مع البيوتين الطازج 1 يحتوي على 50 ميكرومتر من البيوتين الألكين ، و 2.5 ملي مولار أسكوربات الصوديوم ، و 1x مركب BTTAA-CuSO₄ في PBS.
2. قم بإزالة الإدخالات من ألواح الزراعة المشتركة. استنشق وسط الثقافة من الآبار السفلية واغسل الخلايا العصبية مرة واحدة باستخدام PBS الدافئ مسبقا.
3. استنشق PBS من الآبار. أضف 1 مل من محلول PBS المبرد مسبقا بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد لكل بئر إلى الخلايا وقم بإصلاحها في RT لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS المبرد مسبقا.
4. استنشق PBS من الآبار وأضف 1 مل من المخزن المؤقت المترافق بالبيوتين المحضر حديثا 1 لكل بئر في الخلايا. احتضان الخلايا في RT لمدة 10 دقائق.
5. استنشق المخزن المؤقت للتفاعل من الآبار. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS. تحضير مخزن التلوين الذي يحتوي على 1٪ FBS و 1 ميكروغرام / مل Alexa Fluor 647-Streptavidin. أضف 1 مل من مخزن التلوين لكل بئر في الخلايا واحتضن الخلايا في RT لمدة 30 دقيقة.
6. استنشق المخزن المؤقت للتلطيخ من الآبار واغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS المبرد مسبقا. قم بإعداد المخزن المؤقت للحجب الذي يحتوي على 5٪ BSA و 0.3٪ منظف غير أيوني -100 في PBS. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للحجب لكل بئر في الخلايا واحتضنه في RT لمدة 10 دقائق.
7. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأولية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة المضادة للنستين والمضادة β توبولين III معا في المخزن المؤقت المانع بنسب 1:20 و 1: 1,000 على التوالي. قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب من الآبار وأضف 1 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل بئر في الخلايا. احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
8. قم بإزالة محلول الجسم المضاد الأساسي من الآبار. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS المبرد مسبقا. قم بإعداد محلول ثانوي للأجسام المضادة عن طريق تخفيف Alexa Fluor 488 المضاد للفأر IgG1 و Alexa Fluor 546 الماعز المضاد للفأر IgG2b و DAPI معا في مانع المخزن المؤقت عند تخفيف 1: 1,000. استنشق PBS من الآبار وأضف 1 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر في الخلايا. احتضان الخلايا في RT لمدة 2 ساعة.
9. قم بشفط محلول الأجسام المضادة من الآبار واغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS المبرد مسبقا. بعد ذلك ، تكون الخلايا جاهزة لالتقاط الصور.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10099141 10٪ بارافورمالدهيد سيغما 158127 4٪ دابي جيبكو 62248 6 آبار لوحة كورنينج 3335 الفأر أحادي النسيلة مضاد ل Nestin دراسة تطورية بنك الورم الهجين جرذ 401 1 إلى 20 الفأر أحادي النسيلة مضاد بيتا توبولين III سيغما تي 8860 1 إلى 1000 أليكسا فلور 488 ماعز مضاد للفأر IgG1 إنفيتروجين أ -21121 1 إلى 1000 أليكسا فلور 546 ماعز مضاد للفأر IgG2b إنفيتروجين أ -21143 1 إلى 1000 تريتون X-100 أمريسكو 694 م كبريتات النحاس سيغما 209198 الألكين البيوتين انقر فوق أدوات الكيمياء TA105 BTTAA انقر فوق أدوات الكيمياء 1236 أسكوربات الصوديوم سيغما أ 4034 طحين اليكسا 647 ستربتافيدين مترافق إنفيتروجين S21374 1 إلى 1000