التقييم في المختبر ل β الأميلويد المجمعة على انهيار مخروط نمو الخلايا العصبية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Kuboyama، T. تصور انهيار مخروط النمو المحوري وتأثيرات β الأميلويد المبكرة في الخلايا العصبية للفأر المستنبتة. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تقييما في المختبر لانهيار مخروط نمو الخلايا العصبية بواسطة مجاميع β الأميلويد (Aβ). يؤدي علاج الخلايا العصبية بمجاميع Aβ إلى زعزعة استقرار الهيكل الخلوي ، مما يؤدي إلى انهيار مخاريط النمو عند طرف المحاور. تتم مقارنة الخلايا المعالجة بالخلايا الضابطة لتقييم مدى انهيار مخروط النمو.

البروتوكول

1. طي الفحص

1. بولي دي ليسين جأوتينغ
   1. قم بتغطية شرائح الاستزراع المكونة من 8 آبار ب 400 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل بولي دي ليسين (PDL) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
   2. قم بإزالة محلول PDL واغسل الآبار 3 مرات بالماء المقطر.
2. ثقافة الخلايا العصبية
   1. افرم القشرة الدماغية المعزولة حديثا من اليوم الجنيني 14 (E14) ddY (Deutschland و Denken و Yoken) الفئران ذات المقص الدقيق في وسط زراعة الخلايا العصبية التي تحتوي على 12٪ مصل حصان ، 0.6٪ جلوكوز ، و 2 ملي مولار L-جلوتامين (متوسط A). لا تضيف المضادات الحيوية.
      ملاحظه: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام ماوس ddY. هذه سلالة متناثرة شائعة الاستخدام في اليابان. يمكن أيضا تطبيق بروتوكول ثقافة الخلايا العصبية هذا على الخلايا العصبية القشرية للفئران.
   2. جهاز الطرد المركزي للأنسجة عند 87 × جم لمدة 3 دقائق.
   3. قم بإزالة المادة الطافية. ثم أضف إلى الحبيبات 2 مل من 0.05٪ التربسين واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   4. أضف 4 مل من متوسط A واخلطه عن طريق النقر.
   قم
   5. بالطرد المركزي للأنسجة عند 178 × جم لمدة 3 دقائق.
   6. قم بإزالة المادة الطافية ، واحتضان الأنسجة ب 600 وحدة / مل ديوكسيربونوكلياز I (DNase I) و 0.3 مجم / مل مثبط تربسين فول الصويا المذاب في PBS لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   7. بعد الحضانة ، أضف 4 مل من متوسط A واخلطه عن طريق النقر.
   قم
   8. بالطرد المركزي للأنسجة عند 178 × جم لمدة 3 دقائق.
   9. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف 4 مل من متوسط A وقم بتقطيع الأنسجة بماصة باستور مصقولة.
   10. قم بتصفية الأنسجة الثلاثية بشبكة بحجم المسام 70 ميكرومتر. بعد الترشيح ، احسب كثافة الخلايا باستخدام مقياس الدم.
   11. قم بزراعة الخلايا في شريحة الثقافة المكونة من 8 آبار عند 0.8 × 10⁴ خلايا / بئر مع متوسط A واحتفظ بها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ مع جو مرطب بنسبة 10٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية.
   12. بعد 4 ساعات من الاستزراع ، استبدل وسط المزرعة بوسط يحتوي على مكمل غذائي يحتوي على 2٪ للثقافة العصبية ، و 0.6٪ جلوكوز ، و 2 ملي مولار L-Glutamine (متوسط B).
       ملاحظه: كان نقاء الخلايا العصبية حوالي 75٪ ، كما هو موضح سابقا.
3. اختبار الانهيار
   1. قم بإذابة الأميلويد كامل الطول β1-42 (Aβ1-42) الذي تم الحصول عليه تجاريا في ماء مقطر بتركيز 0.5 ملي مولار واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام. بعد الحضانة ، قم بتخزين محلول Aβ1-42 المجمعة في فريزر -30 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظه: هذه الحضانة ضرورية لتجميع وسمية Aβ.
   2. بعد 4 أيام من الثقافة العصبية ، عالج الآبار ب 100 ميكرولتر من الوسط الجديد B ، الذي يحتوي على 0.5 ميكرومتر مجمعة Aβ1-42 أو محلول مركبة (ماء مقطر) لمدة 1 ساعة
      ملاحظه: زادت تأثيرات Aβ1-42 اعتمادا على الجرعة من 0.1 إلى 5 ميكرومتر وبلغت ذروتها عند 0.5 ميكرومتر كما هو موضح سابقا. يمكن ملاحظة نتائج مماثلة عند العلاج Aβ1-42 لمدة ساعة واحدة بعد 3 أيام من الثقافة العصبية.
   3. قم بإزالة وسط الثقافة وقم بإصلاح الخلايا العصبية على الفور بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد تحتوي على 4٪ سكروز في PBS لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية على صفيحة ساخنة.
   4. بعد التثبيت ، اغسل الخلايا العصبية 3 مرات باستخدام PBS وقم بتركيبها بوسط تركيب مائي. جفف وسط التركيب عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 أيام.
   5. التقط المساحة بأكملها (7.8 × 9 مم²) من كل بئر باستخدام عدسة موضوعية جافة 20X على مجهر مقلوب.
   6. صنف أطول الخلايا العصبية لكل خلية عصبية في المرحلة 3 أو 4 على أنها محاور عصبية ، كما هو موضح سابقا.
   7. تصنيف مخاريط النمو وفقا للمعايير التالية: 1) تعتبر مخاريط النمو المحورية التي تفتقر إلى صفيحة الأرجل أو 2) التي تمتلك أقل من ثلاثة مخاريط نمو منهارة ، كما هو موضح سابقا.
      ملاحظه: يتم تسجيل مخاريط النمو الصحية على أنها 0 نقطة. يتم تسجيل مخاريط النمو المنهارة على أنها نقطة واحدة. يتم حساب متوسط درجات الانهيار لكل علاج.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات فئران ddY SLC شريحة ثقافة ثمانية آبار صقر 354108 بولي د ليسين واكو 168-19041 وسط الثقافة ، الوسط العصبي القاعدي جيبكو هاتف: 21103-049 مصل البيت جيبكو هاتف: 26050-088 الجلوكوز واكو 049-31165 ل-جلوتامين واكو 074-00522 0.05٪ التربسين جيبكو هاتف: 25300-054 DNase I ورثينجتون موانئ دبي مثبط فول الصويا التربسين جيبكو 17075-029 مرشح بحجم شبكة 70 ميكرومتر ، مصفاة خلية صقر هاتف: 352350 مكمل B-27 جيبكو 17504-044 حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ أستيك SCA-165DS الأميلويد β1-42 سيجما ألدريتش أ 9810 بارافورمالدهيد واكو 162-16065 سكروز واكو 196-00015 وسط تركيب مائي ، AquaPoly / جبل العلوم المتعددة 18606-20 المجهر المقلوب أ كارل زايس أكسيو أوبزرفر Z1 متصل ب AxioCam MRm ووحدة التسخين XL S ووحدة CO2 S1 وTempModule S1 الخطة الموضوعية - Apochromat 20x كارل زايس هاتف: 420650-9901