تصور ببتيدات أميلويد بيتا في شرائح الدماغ القشرية البشرية

الملخص

المصدر: Ikegawa, M. et al. تصور رواسب β الأميلويد في الدماغ البشري باستخدام قياس الطيف الكتلي للامتصاص بالليزر / التصوير المؤين بمساعدة المصفوفة. J. Vis. Exp. (2019)

< p class = "jove_content">يوضح الفيديو إجراء لإعداد شرائح الدماغ القشرية البشرية من مرضى الزهايمر لتحليل ترسب ببتيدات الأميلويد بيتا (Aβ) باستخدام قياس الطيف الكتلي للامتصاص بالليزر / التصوير بالتأين بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS). تشمل الخطوات تحضير الشرائح ، ومعالجة الأنسجة لتعزيز التأين ، وتحليل التوزيع المكاني لببتيدات أميلويد بيتا.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تحضير أقسام الأنسجة لتصوير قياس الطيف الكتلي (IMS)

1. معالجة عينة الأنسجة من تشريح الدماغ البشري
   ملاحظه: تأكد من أن خطوة تحضير العينة ل IMS تحافظ على الحالة الأصلية للأنسجة. تجنب التلوث وتغييرات ما بعد الوفاة. الخطوة التالية حاسمة.
   1. احصل على عينات قشرية بشرية ل IMS من الأدمغة التي تمت إزالتها ومعالجتها وتخزينها عند -80 درجة مئوية خلال 8 ساعات بعد الوفاة. خذ عينة الدماغ من القشرة القذالية لمرضى الزهايمر (AD) والضوابط المطابقة للعمر.
2. تحضير أقسام الأنسجة المجمدة
   1. قطع أقسام الأنسجة على ناظم البرد. ضع شرائح زجاجية مطلية بالمجهر الموصل بأكسيد الإنديوم والقصدير (ITO) داخل جهاز التبريد.
   2. قم بتسخين عينة تشريح الجثة من -80 درجة مئوية إلى -22 درجة مئوية داخل جهاز التبريد.
   3. قم بتوصيل شفرة جديدة يمكن التخلص منها بناظمة التبريد لكل تجربة. حاول دائما استخدام جزء نظيف من الشفرة.
   4. ضع أدمغة تشريح الجثة المجمدة على المسرح مع كمية صغيرة من مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) (بما يكفي لتغطية المنطقة المركزية من المرحلة ؛ انظر جدول المواد).
   5. اختر شروط التقسيم الرقيق. بالنسبة إلى IMS ، استخدم سمك 10-12 ميكرومتر لأقسام الدماغ البشري. بالنسبة إلى IMS والكيمياء المناعية (IHC) ، قم بقص خمسة إلى ستة أقسام من كل عينة من الأنسجة.
   6. عندما تبدأ الشفرة للتو في قطع الأنسجة ، أدر العجلة و "واجه" الكتلة حتى تنكشف كل الأنسجة. إذا كان هناك خط صغير أو تمزق عبر القسم ، فانتظر أكثر قليلا في ناظم البرد حتى يقوم ضبط درجة الحرارة بإصلاحه تلقائيا. عد بضع ثوان قبل فتح المضاد للدحرجة مع وجود منديل تحته.
   7. ضع شريحة المناديل على الفور على الجانب المطلي ب ITO من الشريحة الزجاجية. قم بإذابة شريحة المناديل عن طريق وضع إصبع أسفل الشريحة على الجانب غير المطلي ب ITO. سوف تلتصق الأنسجة بالشريحة. تأكد من أن الأنسجة مسطحة قدر الإمكان بدون تجاعيد. قم بتنفيذ هذه الخطوة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظه: ارتد القفازات والأقنعة وثوب المختبر لأن العينات البشرية قد تحتوي على ملوثات بيولوجية. عندما يتم عمل جميع الأقسام لهذا اليوم ، قم بتنظيف ناظف التبريد والفرش والخراطيش بمناديل معملية و 200 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
3. شطف أقسام الأنسجة
   1. اغمر العينات في 40-100 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 30 ثانية لإزالة الدهون الداخلية والأملاح غير العضوية. استخدم جرة تلطيخ زجاجية.
   2. اغسل العينات ب 40-100 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 ثانية ، و 40-100 مل من محلول كارنوي لمدة 3 دقائق ، و 40-100 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 ثانية ، و 40-100 مل من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 0.1٪ (TFA) لمدة دقيقة واحدة ، و 40-100 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 ثانية. استخدم جرة تلطيخ زجاجية.
      ملاحظه: محلول كارنوي عبارة عن مثبت يتكون من ستة أجزاء من الإيثانول وثلاثة أجزاء من حمض الخليك وجزء واحد من الكلوروفورم.
   3. يجف في فراغ لمدة 30 دقيقة.
4. معالجة أقسام الأنسجة ببخار حمض الفورميك لتحسين تأين بروتينات Aβ من أنسجة الدماغ لتشريح الجثة
   1. قم بإعداد الفرن وشريحة زجاج الحضانة لاستخدامها في التبخير اللاحق مع 5 مل من حمض الفورميك 100٪. لتحقيق معالجة حمضية مرضية ، حافظ على رطوبة الهواء في طبق زجاج الحضانة عند مستوى التشبع طوال هذه الخطوة وحافظ على درجة الحرارة عند 60 درجة مئوية. ضع شرائح الأنسجة في طبق زجاج الحضانة مع تجنب الغمر في حمض الفورميك وعالجها لمدة 6 دقائق.
   2. التقط صورة بصرية للعينات باستخدام ماسح ضوئي للأفلام أو ماسح ضوئي هلامي أو مجهر رقمي وما إلى ذلك. قم بتنفيذ هذه الخطوة في درجة حرارة الغرفة. تعد محاذاة الصورة البصرية للعينات ضرورية عند وضع هدف العينة داخل الجهاز. عادة ، لن يكون من الممكن التعرف على قسم الأنسجة أسفل طبقة المصفوفة.
      ملاحظة: الطريقة الأكثر ملاءمة لالتقاط صورة بصرية هي استخدام ماسح ضوئي مكتبي. من الجيد حفظ الصورة في مجلد تخزين بيانات التصوير.
   3. لربط الصور البصرية بالعينات، قم بعمل علامات إرشادية مرئية في كل من الصورة البصرية وأسفل طبقة المصفوفة في الكاميرا البصرية. أسهل طريقة هي تحديد ثلاث علامات سائل تصحيح على الأقل حول العينة قبل التقاط الصورة البصرية.
5. تطبيق المصفوفة
   1. تحضير محلول المصفوفة
      1. في أنبوب صغير عضوي يتحمل المذيبات ، قم بإعداد محلول حمض السينابينيك (SA) 10 مجم / مل في 50٪ أسيتونيتريل (ACN) و 0.1٪ TFA. قم بإذابة مركب SA تماما عن طريق الدوامة أو صوتنة قصيرة لمدة 10 دقائق. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
         ملاحظة: هناك ثلاثة خيارات مختلفة لرش المصفوفة: باستخدام البخاخة أو البخاخ بالموجات فوق الصوتية أو البخاخ التلقائي.
   2. رش المصفوفة بالبخاخة
      1. قم بإجراء العملية عند درجة حرارة ثابتة للغرفة (20-23 درجة مئوية) ورطوبة (40٪ -60٪). تشمل المعلمات المراد ضبطها للرش الأمثل حجم القطرة وكمية الضباب والزاوية والمسافة بين فوهة الرش وقسم الأنسجة ودرجة حرارة المختبر والرطوبة. اضبط هذه الشروط عن طريق التحقق من نتائج الفحص المجهري.
         ملاحظه: نظرا لأن العوامل المحددة تشمل حجم البلورة وتجانس تغطية المصفوفة والهجرة / الانتشار غير المرغوب فيه للتحليلات ، فإن الأصغر هو الأفضل لحجم القطرة. التجانس هو أيضا نقطة التفتيش.
   3. رش المصفوفة بالبخاخ بالموجات فوق الصوتية
      1. قم بإزالة المنديل المراد رشه من المجفف وضعه في الغرفة. تأكد من أن الأنسجة لا تغطي نافذة المستشعر.
      2. ابدأ التحضير بالضغط على زر البدء ؛ عادة ما يكون وقت التحضير حوالي 90 دقيقة. سيتم تنظيم التحضير تلقائيا من خلال مراقبة سمك طبقة المصفوفة والبلل. بعد اكتمال التحضير ، قم بإزالة الشريحة وتخزينها في المجفف لمدة 15 دقيقة قبل قراءتها في أداة MALDI.
      3. نظف البخاخ ب 2-3 مل من الميثانول بنسبة 100٪ (MeOH) حتى يبدو رأس الرش نظيفا.
         ملاحظه: يسمح لضباب ناعم من قطرات المصفوفة بالغرق في الأنسجة بواسطة ورقة الجاذبية. يتم إنشاء متوسط حجم قطرة يبلغ 20 ميكرومتر. جميع أقطار القطرات أقل من 50 ميكرومتر.
   4. رش المصفوفة بالبخاخ الأوتوماتيكي
      1. رش محلول المصفوفة على سطح الأنسجة باستخدام بخاخ تلقائي. سيتم تسليم تدفق مستمر لغاز الغلاف الساخن (N₂ ، تم ضبطه عند 10 رطل لكل بوصة مربعة و 75 درجة مئوية) جنبا إلى جنب مع رذاذ محلول المصفوفة. استخدم نظام مضخة المذيبات (تم ضبطه على 10 رطل لكل بوصة مربعة و 0.15 مل / دقيقة) لتقديم محلول المصفوفة.
         ملاحظه: الأهم من ذلك ، العمل تحت خزانة أمان لتجنب أي استنشاق للهباء الجوي المصفوفة. التحكم في درجة حرارة الغرفة والرطوبة لإعادة إنتاج بلورة المصفوفة المتجانسة.

2. MALDI-IMS

1. إجراء قياس الطيف الكتلي فائق السرعة.
   1. قم بإجراء تجارب تصوير عالية الإنتاجية وعالية الدقة المكانية باستخدام MALDI-IMS المزود بليزر عقيق ألومنيوم إيتريوم مخدر بالنيوديميوم 10 كيلو هرتز (Nd: YAG ، 355 نانومتر).
   2. لقياسات قياس الطيف الكتلي ، حدد مناطق الأنسجة باستخدام برنامج التحكم MALDI وبرنامج تحليل البيانات.
   3. اكتساب أطياف في وضع خطي موجب بنطاق كتلي يتراوح بين 2,000-20,000 ودقة مكانية تتراوح بين 20 و100 ميكرومتر.
   4. لعمل معيار المعايرة ، قم بإذابة معيار معايرة الببتيد ومعيار معايرة البروتين بنسبة 1: 4 مع حمض ألفا سيانو-4-هيدروكسيل سيناميك (CHCA) في محلول TA30 (ACN: 0.1٪ TFA = 30:70) ثم قم بتخفيفه 10x. ضع 1 ميكرولتر من معيار المعايرة على الشريحة في أربعة مواقع مختلفة.
2. باستخدام برنامج الأنسجة الجزيئية (انظر جدول المواد) ، قم بتراكب صور مفردة متعددة للعثور على الارتباط المكاني للإشارات المختلفة ، مثل ببتيدات Aβ المختلفة المتزامنة في لويحات الشيخوخة (SPs) وجدران الشرايين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كرايوستات لايكا مايكروسيستمز ، ويتزلار ، ألمانيا سم 1950 شريحة زجاجية مجهرية مطلية بأكسيد القصدير الإنديوم (ITO) بروكر دالتونيكس #237001 شفرة (يمكن التخلص منها) لايكا مايكروسيستمز ، ويتزلار ، ألمانيا #117394 O.C.T. كمبوند لايكا مايكروسيستمز ، ويتزلار ، ألمانيا FSC 22 أزرق ماسح ضوئي إبسون جي تي -980 فرشاة الهواء GSI Creos جهاز بلاي ستي 274 الضاغط مرهوبي ضاغط Mr.Linear L5 بخاخ بالموجات فوق الصوتية بروكر دالتونيكس الإعداد للصور بخاخ أوتوماتيكي تقنيات HTX بخاخ TM المسح الضوئي بالليزر المحدب المجهر شركة كارل زايس إل إس إم 700 أداة MALDI فائقة السرعة بروكر دالتونيكس rapifleX MALDI Tissuetyper برنامج التحكم MALDI بروكر دالتونيكس فليكس كونترول 3.8 برنامج علم الأنسجة الجزيئي SCiLS ، بريمن ، ألمانيا مختبر SciLS 2016 أ حمض السينابينيك (SA) ناكالاي تيسك 30494-91 حمض ألفا سيانو-4-هيدروكسيل سيناميك (CHCA) واكو 037-19261 معيار المعايرة بروكر دالتونيكس