الكشف عن النزيف الدماغي الدقيق في نموذج الفئران

الملخص

المصدر: Li ، D. ، Zhào ، H. ، et al. النزيف الدماغي الدقيق تحت الحاد الناجم عن حقن عديدات السكاريد الدهنية في الفئران. (2018).

يوضح هذا الفيديو فحصا للكشف عن النزيف الدماغي الدقيق (CMHs) في نموذج الفئران. CMHs هي نزيف في الدماغ بسبب اضطراب الحاجز الدموي الدماغي ، والذي يتم تحديده بواسطة خلايا الدم الحمراء المتسربة (كرات الدم الحمراء). في نموذج الفئران ، تكون أنسجة المخ الثابتة محمية بالتبريد ، ومقسمة ، وملطخة بالهيماتوكسيلين يوزين لكرات الدم الحمراء ، مما يسمح بالتصور المجهري ل CMHs. تظهر كرات الدم الحمراء المسربة باللون الأحمر البرتقالي تحت المجهر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< ص الفئة = "jove_title" >1. المواد

1. تحضير حقن عديدات السكاريد الدهنية (LPS)
   1. أضف 25 مل من الماء المقطر إلى 25 مجم من مسحوق LPS المشتق من السالمونيلا التيفيموريوم إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل. قم بتخزين الحقن في أنبوب معقم عند 4 درجات مئوية
      أنذر: LPS سام.
   2. قم بإعداد محلول إيفانز الأزرق 2٪ (EB) في محلول ملحي عادي بنسبة 0.9٪ للحفاظ على حقن EB في تركيز العمل.

< p class = "jove_title" >2.

< p class = "jove_content" > قم بإعطاء LPS لذكور فئران Sprague-Dawley (SD) ، الذين تتراوح أعمارهم بين 10 أسابيع (متوسط الوزن: 280 ± 20 جم) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
أنذر: إذا تم شراء الفئران من منظمة أخرى ، فيجب ألا تقل المرحلة التكيفية عن 7 أيام.

فئة

3. حقن LPS

1. حقن LPS داخل الصفاق في كل فأر بجرعة 1 ملغ/كغ وإعادة الفئران إلى قفص منزلهم.
   ملاحظه: التخدير ليس ضروريا.
2. بعد ست ساعات ، قم بحقن نفس الجرعة من حقن LPS في الفئران.
3. بعد ستة عشر ساعة حقن نفس جرعة LPS في الفئران.
   أنذر: قد يؤدي حقن الفئران SD بجرعة 1 مجم / كجم إلى معدل وفيات بنسبة 5٪. يمكن أن يزداد معدل الوفيات في الفئران الأصغر سنا أو الأكبر سنا أو إناث الفئران الحوامل.
4. أعد الفئران إلى أقفاصها بعد حقن LPS ووفر الوصول المخصص إلى الطعام والشراب.
   ملاحظه: ستظهر الفئران استجابة التهابية جهازية مميزة ، وبالتالي من الضروري أن تظل الأقفاص نظيفة طوال التجربة. يجب أن تكون الفئران بشكل متكرر (2x يوم) مراقبة للوزن والمظهر العام والموقف بعد حقن LPS الأول. إذا بدأت الفئران في إظهار وضعية منحنية ، وعدم الرغبة في الحركة ، وفقدان الوزن بشكل كبير (>20٪) ، تلطيخ البورفيرين أن يتم قتلها رحيما بشكل إنساني قبل نقطة نهاية دراسة EB لمدة 7 أيام.

< p class = "jove_title" >4. جمع العينات

1. حقن EB
   1. بعد سبعة أيام من الحقنة الأولى ، قم بتخدير الجرذ داخل الصفاق وفقا لبروتوكول IACUC المعتمد الخاص بك.
   2. انتظر 1-2 دقيقة حتى لا تظهر الفئران استجابات انعكاسية للقرنية. إجراء ثقب قلبي بعمق 5-8 مم على كل فأر. يجب أن تكون نقطة الثقب 5 مم إلى الهامش الأيسر من القص في الفضاء الوربي الثالث والرابع.
   3. انتظر حتى يتم ملاحظة تعافي الدم ، ثم حقن EB بجرعة 0.2 مل / 100 غرام من وزن الجسم في البطين الأيسر للقلب.
      أنذر: يجب إجراء ثقب القلب وحقن EB بعناية. قد يتم حقن EB في التجويف الصدري أو التامور بدلا من البطين الأيسر للقلب.
      1. امتصاص مرة أخرى بأنبوب فارغ واستبدل هذا الحجم بأنبوب EB قبل الحقن للمساعدة في تقليل معدل الفشل (على سبيل المثال ، الحقن في القفص الصدري عن طريق الخطأ).
   4. احتفظ بالجرذ في وضع ضعيف لمدة 10 دقائق < / > ملاحظة: إذا لم يتم استخدام العينة للكشف عن تسرب EB في التصوير المناعي الفلوري ، فقد يتم حذف هذه الخطوة.
2. الملاحظة الإجمالية
   1. قم بإجراء تروية القلب باستخدام محلول ملحي عازل للفوسفات 1 متر (PBS) لتنظيف الأوعية الدموية الدماغية والدماغ.
      1. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق في البطن على طول الحجاب الحاجز بالكامل.
      2. قطع الأضلاع اليسار من خط الوسط للقفص الصدري.
      3. افتح التجويف الصدري. استخدم المشابك لكشف القلب وتسهيل تصريف الدم والسوائل الأخرى.
      4. أثناء إمساك القلب بثبات بالملقط (يجب أن يظل القلب ينبض) ، أدخل إبرة مباشرة في نتوء البطين الأيسر لتمديده إلى حوالي 5 مم. قم بتأمين الإبرة في هذا الوضع عن طريق التثبيت بالقرب من نقطة الدخول.
         أنذر: لا تقم بتمديد الإبرة بشكل مفرط ، لأنها يمكن أن تخترق الجدار الداخلي وتضر بدوران المحاليل.
      5. حرر الصمام للسماح بتدفق محلول PBS البارد (200-300 مل) بمعدل بطيء وثابت عند حوالي 20 مل / دقيقة باستخدام مضخة التروية. إذا كانت تتطلب التثبيت بدلا من الملاحظة الإجمالية ، فاستخدم نفس الجرعة من محلول ملحي مثلج 0.9٪.
      6. باستخدام مقص حاد ، قم بعمل شق في الأذين ، مع ضمان تدفق المحلول باستمرار. إذا كان السائل لا يتدفق بحرية أو قادم من أنف أو فمه ، فقم بتغيير وضع الإبرة.
   2. فحص CMHs عن طريق الملاحظة الإجمالية.
      ملاحظه: إذا لم يتم استخدام العينة في حساب عدد CMHs عن طريق الملاحظة الإجمالية ، فقد يتم حذف هذه الخطوة.
3. تثبيت
   1. إجراء تروية القلب باستخدام محلول ملحي مثلج 0.9٪ (200-300 مل) لتنظيف الأوعية الدموية الدماغية والدماغ.
   2. إجراء تروية القلب باستخدام المثلج البارد 4٪ بارافورمالدهيد للتثبيت.
   3. اقطع رأس الفئران وعزل الدماغ واغمر الدماغ في محلول سكروز بنسبة 20٪ لمدة 6 ساعات على الأقل.
   4. قم بتغيير المحلول إلى 30٪ من السكروز وقم بإصلاحه لمدة 6 ساعات أخرى.
4. قم بإعداد أقسام أنسجة المخ بسمك 10 مم باستخدام ناظم البرد.

< p class = "jove_title" >5. تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (HE)

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام مجموعة تلطيخ HE.

1. اغسل الشرائح بالماء المقطر.
2. وصمة عار في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 8 دقائق.
3. تفريق في 1٪ كحول حمضي لمدة 30 ثانية. يغسل بماء الصنبور الجاري لمدة 1 دقيقة.
4. وصمة عار في ماء الأمونيا 0.2٪ (زرقرق) أو محلول كربونات الليثيوم المشبع لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة.
5. اشطفها بالكحول بنسبة 95٪ (10 غمسات).
6. مضاد للبقع بمحلول اليوزين لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة.
7. يجفف من خلال الكحول بنسبة 95٪ ، وتغييران من الكحول المطلق ، لمدة 5 دقائق لكل منهما.
8. شفاف في الزيلين لمدة 30 ثانية.
9. جبل باستخدام طريقة ليو.
10. التحليل باستخدام مجهر مضان المجال الساطع.
    ملاحظه: تظهر خلايا الدم الحمراء المنبعثة من الأوعية الدموية ، وهي مكونات CMHs ، باللون الأحمر البرتقالي تحت تلطيخ HE.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات لبس سيجما ألدريتش L-2630 لتحريض الالتهاب البورصة الإلكترونية سيجما ألدريتش E2129 للكشف عن تسرب EB تلطيخ سولاربيو جي 1120 طقم لتلوين HE كلورال هيدرات سيجما ألدريتش 47335 وحدة للتخدير محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) سولاربيو ص 1022 نوع من المحلول العازل شائع الاستخدام في التجربة محلول ملحي 0.9٪ هاينان دونجليانتشانغفو الصيدلانية المحدودة ، الصين حل للتروية بارافورمالدهيد سيجما ألدريتش 158127 نوع من الحلول يشيع استخدامها للتثبيت محلول سكروز 20٪ سولاربيو جي 2461 نوع من الحلول يشيع استخدامها للتثبيت محلول السكروز 30٪ سولاربيو جي 2460 نوع من الحلول يشيع استخدامها للتثبيت مرهم بيطري جل العين Solcoseryl ، باسل ، سويسرا لحماية عيون الفئران