تحضير الخلايا العصبية المستنبتة للتحليل البصري للحويصلات المشبكية المعاد تدويرها

الملخص

المصدر: Riemann، D. et al. ، فحص بصري لإعادة تدوير الحويصلة المشبكية في الخلايا العصبية المستنبتة التي تفرط في التعبير عن البروتينات قبل المشبكي. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو إجراء إعداد الخلايا العصبية المستنبتة للتحليل البصري للحويصلات المشبكية المعاد تدويرها. تتضمن العملية وضع علامات مضان لبروتينات الحويصلة المشبكية والتلوين المناعي لتسمية وتصور الحويصلات المعاد تدويرها داخل الخلايا العصبية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. ثقافة خلايا الحصين الأولية

1. تحضير زراعة الخلايا المنفصلة لحصين الفئران في اليوم الجنيني 19. ضع الخلايا على أغطية مقاس 12 مم مطلية بالبولي إيثيلين إيثيلين (PEI) في أطباق مكونة من 24 بئرا بكثافة 50,000 - 60,000 خلية / بئر. تحقق من الكثافة باستخدام غرفة عد الخلايا وبصريات تباين الطور.
2. استزراع الخلايا العصبية لمدة 3 أيام (يوم في المختبر (DIV) 3) في صفيحة 24 بئرا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
3. تقييم أغطية مؤشرات صحة الخلية باستخدام الفحص المجهري الضوئي المنقول (على سبيل المثال ، بصريات تباين الطور بتكبير 10 - 20X). تحقق من المؤشرات التالية للصحة الجيدة: هالة تباين الطور الواضحة ، والعصبيات بدون هياكل مطرز ، وعدم وجود تجمع سوما أو تجميع العصب.

< p class = "jove_title" >2. التعداء

ملاحظة: يشير البروتوكول التالي إلى تعداء مزدوج ل 3 آبار. ومع ذلك ، يعمل البروتوكول بشكل أفضل عندما يتم تحضير كميات كافية ل 4 آبار.

1. تحضير 500 مل من محلول التعداء (274 ملي كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، 10 ملي كلوريد البوتاسيوم ، KCl ، 1.4 ملي فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم ، Na₂HPO₄ ، 15 ملي مولار جلوكوز ، 42 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين إيثان سولفونيك حمض ، HEPES) في قارورة إرلينماير.
   1. قم بإذابة 8.0 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.37 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.095 جم من Na₂HPO₄ ، و 1.35 جم من الجلوكوز ، و 5.0 جم من HEPES في 400 مل من الماء المقطر في قارورة Erlenmeyer.
   2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.95 باستخدام 1 متر من هيدروكسيد الصوديوم ، هيدروكسيد الصوديوم باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
   3. اضبط مستوى الصوت بالماء المقطر على 500 مل وتحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
   4. قم بعمل 20 - 30 مل من المخزن المؤقت للتعداء بقيم الأس الهيدروجيني التالية عن طريق سحب 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى المخزن المؤقت للتعداد: 6.96 ، 6.97 ، 6.98 ، 6.99 ، 7.00 ، 7.01 ، 7.02 ، 7.03 ، 7.04 ، 7.05 ، 7.06 ، 7.07 ، 7.08 ، 7.09 ، 7.11.
      ملاحظة: يعد الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت للتعداء أمرا بالغ الأهمية لفعالية التعدي.
   5. لاختبار المخزن المؤقت للتعداء الذي يؤدي إلى أكبر عدد من الخلايا المنقولة ، اختبر كل قيمة الأس الهيدروجيني من 6.96 إلى 7.11. استخدم طريقة التعداء الموضحة في 2.2 - 2.11 وبلازميد تم التحقق من صحته يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). حدد عدد الخلايا المنقولة لكل غطاء لكل قيمة الأس الهيدروجيني للمخزن المؤقت للتعداء لتقييم المخزن المؤقت الذي يعمل بشكل أفضل.
   قم
   6. بنقل المخزن المؤقت بأعلى كفاءة تعدين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل ، وقم بتجميد الأنابيب وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
2. قم بتسخين وسط المصل المخفف مسبقا ، ووسط زراعة الخلايا ، والماء المقطر إلى 37 درجة مئوية في الحمام المائي.
3. تحضير مزيج التعداء في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. اعمل تحت غطاء التدفق الصفحي لضمان ظروف عمل معقمة.
   1. امزج 7.5 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم 2 M مع 4 ميكروغرام من كل DNA خال من السموم الداخلية (Synaptophysin-mOrange و mGFP / GFP-Rogdi). أضف الماء ليصل إلى الحجم الإجمالي 60 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
   2. أضف 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتعداء إلى المزيج. للحصول على أفضل النتائج ، أضف المخزن المؤقت للتعداء بالتنقيط أثناء هز مزيج الحمض النووي برفق على الدوامة.
   3. احتضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة. تجنب هز أنبوب الحضانة أثناء وقت الحضانة عن طريق وضع الأنبوب بجوار غطاء التدفق الرقائقي.
4. تحت غطاء التدفق الرقائقي ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا ("الوسط المكيف") من الآبار باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر وقم بتخزينها في حاوية منفصلة في الحاضنة.
5. أضف 500 ميكرولتر من وسط المصل المختزل إلى كل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى تنتهي فترة الحضانة التي تبلغ 20 دقيقة (الخطوة 2.3.3).
6. أضف 30 ميكرولتر من مزيج التعداء إلى كل بئر عن طريق سحب عدة قطرات. تخلص من البقايا الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب.
7. بعد تزويد جميع الآبار بمزيج التعداء ، قم بهز الصفيحة المكونة من 24 بئرا برفق لضمان توزيع مزيج التعداء في الوسط.
8. احتضان الآبار لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
9. قم بإزالة مزيج الإرسال والتخلص منه واغسله ثلاث مرات بوسط زراعة الخلايا. أضف 1 مل من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر واحتضنها لمدة 30 ثانية في RT. قم بإزالة 750 ميكرولتر من الوسط وأضف نفس الكمية من الوسط الطازج. كرر هذا ثلاث مرات.
   ملاحظة: خطوة الغسيل أمر بالغ الأهمية. احتفظ بالوقت الذي لا يحتوي فيه كل بئر على وسيط على الأقل (أي قم بإزالته واستبداله جيدا بئر) وأضف وسط الغسيل برفق.
10. قم بإزالة وسط زراعة الخلية والتخلص منه وإضافة 450 ميكرولتر من الوسط المكيف جيدا بئر.
11. دع الخلايا العصبية تنضج في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ إلى DIV 10.

< p class = "jove_title" >3. التحفيز وامتصاص Syt1

ملاحظة: يطبق البروتوكول التالي الامتصاص على 3 آبار. لإزالة الاستقطاب من أي عدد آخر من الآبار ، اضبط الكميات وفقا لذلك.

1. تحضير 50 مل من محلول إزالة الاستقطاب 10x (640 ملي كلوريد الصوديوم ، 700 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي كلوريد المغنيسيوم ، MgCl₂ ، 20 ملي كلوريد الكالسيوم ، كلوريد الكالسيوم₂ ، 300 ملي مولار جلوكوز ، 200 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.4) في قارورة إرلينماير.
   ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بمخزن إزالة الاستقطاب عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع. إذا تم استخدام محلول غير مزيل للاستقطاب أيضا ، فقم بإعداد محلول Tyrode 10x يتكون من 1290 ملي كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي مولار KCl ، و 10 ملي ملي كلوريد₂ ، و 20 ملي مولار كلوريد_{الملطيض 2} ، و 300 ملي مولار جلوكوز ، و 200 ملي مولار ، ودرجة الحموضة 7.4 من أجل مقارنة إعادة التدوير الناجم عن التحفيز مع إعادة التدوير التلقائي. بعد التخفيف إلى 1x ، أضف 1 ميكرومتر من السموم الرباعية قبل الاستخدام لمنع توليد جهد العمل.
   1. قم بإذابة 1.87 جم من كلوريد الصوديوم ، و 2.61 جم من KCl ، و 0.1 جم من MgCl 2-6H₂O ، و 0.15 جم من CaCl _{2-2H 2}O و 3.0 جم من الجلوكوز -1 H₂O و 2.38 جم من HEPES في 50 مل من الماء المقطر في قارورة Erlenmeyer. اضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وقم بتصفية المحلول بمعقم. خفف المخزن المؤقت 1:10 في الماء المقطر لتحقيق تركيز 1x.
2. تحضير 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) (درجة الحموضة 7.4) للتثبيت بعد التحفيز.
   1. للحصول على 500 مل من 4٪ PFA في 1x PBS ، قم بإذابة 20 جم من بارافورمالدهيد في 450 مل من H₂O.
      ملاحظة: قد يؤدي تسخين المحلول إلى تسريع الذوبان ، لكن لا تسخن المحلول فوق 70 درجة مئوية ، حيث قد يتفكك PFA.
      أنذر: PFA سام ، يحتمل أن يكون مسرطن ، ومجيخ. ارتد القفازات عند العمل مع PFA ، واعمل تحت غطاء الدخان ، وتجنب الابتلاع.
   2. دع المحلول يبرد إلى RT وأضف 50 مل من محلول مخزون PBS 10x. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم / حمض الهيدروكلوريك(حمض الهيدروكلوريك) باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
3. 600 ميكرولتر من 1x عازلة إزالة الاستقطاب و 10 مل من وسط زراعة الخلايا إلى 37 درجة مئوية في الحمام المائي.
4. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للفأر المضاد ل Syt1 (استنساخ 604.2) إلى المخزن المؤقت لإزالة الاستقطاب 1x والدوامة لمدة 10 ثوان.
5. قم بإزالة وسيط زراعة الخلية والتخلص منه من الخلايا. أضف 200 ميكرولتر من مزيج إزالة الاستقطاب والأجسام المضادة إلى كل بئر واحتضنه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في الحاضنة.
6. قم بإزالة مزيج إزالة الاستقطاب والأجسام المضادة والتخلص منه واغسله ثلاث مرات باستخدام وسط زراعة الخلايا. أضف 1 مل من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر واحتضنه لمدة 30 ثانية في RT. قم بإزالة 750 ميكرولتر من الوسط وأضف نفس الكمية من الوسط الطازج. كرر ثلاث مرات.
7. قم بإزالة وسيط زراعة الخلية والتخلص منه وإضافة 300 ميكرولتر من 4٪ PFA في 1x PBS. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
8. يغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع كل منها مع 1x PBS.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

< p class = "jove_title" >4. الكيمياء المناعية

1. تحضير 50 مل من المخزن المؤقت للحظر.
   ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالمخزن المؤقت للحجب عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
   1. قم بإذابة 2.5 جم من السكروز و 1 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في 5 مل من محلول مخزون 10x PBS. أضف 1.5 مل من محلول مخزون المنظفات بنسبة 10٪. قلب المحلول حتى تذوب جميع المكونات بشكل صحيح وأضف H₂O المقطر حتى يصل إلى الحجم النهائي البالغ 50 مل. Aliquot الحل وتجميد الحصص للتخزين.
2. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي المقترن بالفلوروفور (الموجه ضد أنواع الأجسام المضادة Syt1 الأولية) في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع في كل بئر عند تخفيف 1: 1000.
3. قم بإزالة وتجاهل 1x PBS من كل بئر يحتوي على غطاء.
4. أضف 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة العازلة إلى كل بئر واحتضنه لمدة 60 دقيقة في RT.
   أنذر: نظرا لأن الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء ، يجب تنفيذ جميع الخطوات للمضي قدما في الظلام.
5. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام 1 مل من 1x PBS.
6. قم بتضمين أغطية المفاتيح على شرائح المجهر باستخدام وسيط التضمين.
   1. أضف قطرة 7 ميكرولتر من وسط التضمين على شريحة المجهر. قم بإزالة الغطاء من اللوحة المكونة من 24 بئرا عن طريق رفعها بحقنة والإمساك بها بالملقط.
      أنذر: تتلف الخلايا الموجودة على سطح الغطاء بسهولة ، لذلك يجب التعامل مع الملقط بحذر.
   2. اغمس الغطاء في الماء المقطر لإزالة PBS وتجفيفه بعناية عن طريق لمس حافة واحدة للأنسجة الرخوة.
   3. اقلب الغطاء على قطرة متوسطة التضمين ، بحيث يواجه السطح الذي يحمل الخلايا شريحة المجهر ، وبالتالي تضمين الخلايا في وسط التضمين.
7. اترك الشرائح لتجف تحت الغطاء لمدة 1-2 ساعة (قم بتغطيتها لتجنب التعرض للضوء) وقم بتخزينها في صندوق منزلق مجهر عند 4 درجات مئوية < br / > ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

المواد