التلوين المناعي للخلايا العصبية المعالجة بمجاميع ألفا سينوكلين

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Panattoni ، G. ، et al. الإدارة الخارجية لمجاميع ألفا سينوكلين المرتبطة بالميكروسومات إلى الخلايا العصبية الأولية كنموذج خلوي قوي لتكوين الألياف. J. Vis. exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو التلوين المناعي للخلايا العصبية المعالجة بمجاميع ألفا سينوكلين (αS). تتم معالجة الخلايا العصبية أولا بمجاميع αS. ثم يتم إصلاحها ونفاذها ومعالجتها بمحلول منع. تضاف الأجسام المضادة الأولية ، تليها أجسام مضادة ثانوية مصنفة بالفلورسنت وصبغة نووية. ثم يتم تركيب العينة ومراقبتها تحت المجهر.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. علاج الخلايا العصبية

ملاحظة: تم إجراء العلاج في القسم (DIV) 7. يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء زراعة الخلايا في ظروف معقمة. يوضح الشكل 1 مثال على كثافة الثقافة العصبية القشرية في DIV 7.

تم
1. الحصول على مجاميع αS المرتبطة بالميكروسومات من الحبل الشوكي لثلاثة فئران معدلة وراثيا مريضة مختلفة للحصول على محلول 1 ميكروغرام / ميكرولتر ، باستخدام مخزن التجانس الأصلي [يتكون من 250 ملي مولار سكروز ، 20 ملي مولار HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازيلين إيثان سلفونيك حمض) ، 10 ملي مولار KCl (كلوريد البوتاسيوم) ، 1.5 ملي ملي ملغم كلوريد₂ ((كلوريد المغنيسيوم) ، 2 ملي مولار EDTA (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك) ، و 1x مثبطات الفوسفاتيز / البروتياز] للتخفيف.
2. خذ ثقافة الخلايا العصبية على أغطية بولي د-ليسين في 24 لوحة بئر تحتوي على وسط (2٪ B27 ، 10x gentamicin، و 2 ملي مولار من الجلوتامين). قم بإزالة 1/3 من الوسط واستبدله برفق بالوسط الطازج الذي يحتوي على 2٪ B27 و 1x gentamicin و 2 ملي من الجلوتامين.
3. أضف 1 ميكروغرام من مجاميع ألفا سينوكلين (αS) المرتبطة بالميكروسومات المجمعة إلى وسط الخلية. أعد الخلايا العصبية إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
4. كل 3 أيام لمدة أسبوع واحد ، أضف 1/3 من الوسط الطازج. لا تستبدل الوسيط. فقط أضفه.
5. بعد أسبوع واحد من العلاج ، قم بإزالة 1/3 من الوسط واستبدله برفق بالوسط الطازج الذي يحتوي على 2٪ B27 و 10 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين و 2 ملي من الجلوتامين. كرر كل 3 أيام.
6. إصلاح الخلايا العصبية بعد أسبوعين من العلاج (DIV 21).

< ص الفئة = "jove_title" >2. التألق المناعي

1. قم بإصلاح الخلايا العصبية التي تحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1x و 5٪ من محلول السكروز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) دون الاهتزاز تحت غطاء الدخان الكيميائي.
2. قم بإزالة محلول التثبيت. يغسل لفترة وجيزة باستخدام PBS 1x ، 3 مرات.
   ملاحظه: قم بتنفيذ جميع خطوات الغسيل برفق لأن الخلايا العصبية الأولية لا تلتصق بقوة بأغطية بولي لايسين.
3. نفاذية الخلايا العصبية مع 0.3٪ من الفاعل بالسطح غير الأيوني في PBS 1x لمدة 5 دقائق في RT.
4. يغسل لفترة وجيزة باستخدام PBS 1x ، 3 مرات.
5. احتضان الخلايا العصبية بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 3٪ (FBS) في PBS 1x لمدة 30 دقيقة في RT لمنع مواقع الارتباط غير المحددة على شاكر مداري.
6. احتضان الخلايا العصبية بجسم مضاد أولي مناسب مذاب في 3٪ FBS في PBS 1x ، O / N عند 4 درجات مئوية على شاكر مداري.
   ملاحظة: تم استخدام الأجسام المضادة syn303 (1: 1,000) ، والفأر αS (1: 200) ، و pser129-αS (1: 1،000) ، و Tau (1: 10،000).
7. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة واغسله لفترة وجيزة باستخدام PBS 1x ، 3 مرات.
8. احتضان الخلايا العصبية بجسم مضاد ثانوي فلوري مناسب مذاب في 3٪ FBS في PBS لمدة ساعة واحدة في RT في الظلام على شاكر مداري.
9. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة واغسله لفترة وجيزة باستخدام PBS 1x ، 3 مرات.
10. تلطيخ الخلايا العصبية بمحلول DAPI (4 ، 6-diamidino-2-phenylindole) (0.1 ميكروغرام / مل في PBS 1x) لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام على شاكر مداري.
11. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة واغسله لفترة وجيزة باستخدام PBS 1x ، 3 مرات.
12. قم بتركيب أغطية على شريحة باستخدام وسيط تثبيت مضاد للبهتان.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. الثقافات العصبية القشرية. صورة تمثيلية توضح الكثافة في DIV 7 للثقافات العصبية القشرية. تم التقاط الصور بمجهر ضوئي مقلوب ، هدف 10X. شريط المقياس = 100 ميكرومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات سكروز سيجما ألدريتش 84097-1 كجم هيبس سيجما ألدريتش H0887-100 مل 1 متر درجة الحموضة = 7-7.6 EDTA سيجما ألدريتش 0390-100 مل الأس الهيدروجيني = 8 0.5 م كلوريد المغنيسيوم سيجما ألدريتش M8266-100G صودا سيجما ألدريتش إس 7795-500 جي بيكربونات الصوديوم سيجما ألدريتش S5761-500G ميثانول سيجما ألدريتش 322415-6X1L كيه سي إل سيجما ألدريتش ب 9541-500 جرام سي أومبليت ميني روش 11836170001 مثبط الإنزيم البروتيني فوستوب روش 4906837001 مثبط الفوسفاتيز مجموعة فحص البروتين BCA يوروكلون EMPO14500 معيار TGX 4-20٪ خالي من البقع ، 18 بئرا بيوراد 5678094 غشاء النيتروسليلوز المدعوم بيوراد 1620097 0.2 ميكرومتر مانع الصف النشاف بيوراد 1706404 حليب جاف خالي الدسم SuperSignal West Pico الركيزة الكيميائية تيرمو فيشر العلمي 34077 حمض النتريك سيجما ألدريتش 1004411000 65٪ أغطية زجاجية تيرمو فيشر العلمي هاتف: 1014355118NR1 18 مم × بولي د-يسين سيجما ألدريتش P7280 محلول الملح المتوازن من هانك تيرمو فيشر العلمي 14170-500 مل البنسلين / الستربتومايسين تيرمو فيشر العلمي 15140122 10,000 وحدة / مل ، 100 مل وسط النسر المعدل من Dulbecco تيرمو فيشر العلمي D5796-500 مل التربسين EDTA تيرمو فيشر العلمي 15400054 0.50٪ مكمل B27 تيرمو فيشر العلمي 17504044 50 ضعفا جلوتاماكس تيرمو فيشر العلمي 35050-038 100 ضعف الحمض النووي سيجما ألدريتش د5025 مصل الأبقار الجنينية يوروكلون EC50182L الغلوتامات سيجما ألدريتش هاتف 1446600-1 جرام الجنتاميسين تيرمو فيشر العلمي 15710 [م] 10 ملغ/مل الوسط العصبي القاعدي تيرمو فيشر العلمي 10888-022 السيتوزين أرابينوسيد (AraC) سيجما ألدريتش C3350000 وسيط تركيب VECTASHIELD المضاد للبهتان مختبرات ناقلات إتش -1000 دابي تيرمو فيشر العلمي 62247 90 Ti الدوار بيكمان غير متاح دوار الطرد المركزي الفائق جهاز الطرد المركزي الفائق Optima L-90K بيكمان غير متاح الجسم المضاد Syn-1 ، استنساخ 42 BD Biosciences 610786 WB مضاد للماوس: 1: 5000 الجسم المضاد Syn303 بيو ليجند 824301 مضاد للماوس IF: 1: 1000 الجسم المضاد تاو الأنظمة المشبكية 314 002 مكافحة الأرانب إذا: 1: 10،000 الجسم المضاد pser129-αS هدية من فوجيوارا وآخرون ، المرجع 19 WB المضادة للأرانب: 1: 5000 الجسم المضاد pser129-αS أبكام أب51253 مكافحة الأرانب إذا: 1: 1000 الماوس αS (D37A6) XP إشارات الخلية 4179 مضاد للأرانب IF 1:200 أليكسا فلور 555 مترافق الجسم المضاد للأرانب تيرمو فيشر العلمي أ27039 Alexa fluor 488 الجسم المضاد للفأر المترافق تيرمو فيشر العلمي أ -11029 ميكروسون XL-2000 ميسونيكس سونيكاتور زجاجات الترا (زجاجات أوكريدج) ، ثنائي الفينيل متعدد الكلور ، 16 × 76 مم ، التجميع ، غطاء نوريل ، نوع بيكمان خدمة العلوم في الاتحاد الأوروبي إس 4484 أنابيب الطرد المركزي الفائق AXIO Observer مجهر ضوئي مقلوب زييس غير متاح TCS SP2 مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر لايكا غير متاح مجهر epi-fluorescence المقلوب نيكون غير متاح تريتون إكس-100 سيجما ألدريتش X100-500 مل خافض للتوتر السطحي غير أيوني