مقالة منهجية

قياس تنشيط مستقبلات الرائحة باستخدام مقايسة الأدينوزين أحادي الفوسفات الدوري في الوقت الحقيقي

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Zhang ، Y. et al. ، قياس الخلايا الحية لتنشيط مستقبلات الرائحة باستخدام اختبار cAMP في الوقت الفعلي. J. Vis. Exp.(2017)

يوضح هذا الفيديو بروتوكول قياس تنشيط مستقبلات الرائحة في الخلايا المنقولة باستخدام مستشعر حيوي أحادي فوسفات الأدينوزين الدوري (cAMP) واكتشاف التلألؤ. يتم تطبيق الطريقة لدراسة تفاعلات المستقبلات والترابط ومسارات الإشارات في الخلايا العصبية الشمي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحفيز وقياس نشاط مستقبلات الرائحة (OR) باستخدام اختبار cAMP في الوقت الفعلي

  1. راقب الخلايا المنقولة تحت مجهر تباين الطور لضمان التقاء مناسب بنسبة 50-80٪ لكل بئر والعودة إلى الحاضنة.
  2. قم بإعداد وسط التحفيز عن طريق إضافة 10 ملي مولار من حمض هيدروكسي إيثيل بيبرازينات إيثان سلفونيك (HEPES) و 5 ملي مولار من الجلوكوز إلى محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS).
  3. قم بإذابة كاشف الركيزة لفحص cAMP في الوقت الفعلي على الجليد. قم بتخزين كاشف الركيزة عند -80 درجة مئوية عند 55 ميكرولتر لكل أنبوب في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). استخدم 1 أنبوب لكل لوحة.
  4. قم بإعداد محلول توازن بنسبة 2٪ عن طريق خلط 55 ميكرولتر من كاشف الركيزة و 2750 ميكرولتر من محلول HBSS / HEPES / الجلوكوز.
  5. انشر طبقة سميكة من المناشف الورقية على المقعد. اضغط برفق وبشكل متكرر على اللوحة رأسا على عقب على المنشفة الورقية حتى يمتص وسط الإرسال بالكامل.
  6. اغسل الخلايا عن طريق سحب 50 ميكرولتر من محلول HBSS / HEPES / الجلوكوز لكل بئر.
  7. اضغط برفق وبشكل متكرر على محلول HBSS / HEPES / الجلوكوز من اللوحة التي تحتوي على 96 بئرا.
  8. ماصة 25 ميكرولتر من محلول توازن 2٪ لكل بئر وتحتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعتين.
  9. قم بإعداد محاليل مخزون الرائحة 1 متر مسبقا في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  10. قبل نهاية وقت الحضانة ، قم بتخفيف محاليل مخزون الرائحة إلى تركيزات العمل في وسط تحفيز HBSS / HEPES / الجلوكوز.
    ملاحظه: يجب مضاعفة تركيزات تخفيفات الرائحة المحضرة في هذه الخطوة للحصول على التركيزات النهائية الصحيحة في كل بئر.
  11. باستخدام قارئ لوحة التلألؤ الكيميائي وقبل إضافة الرائحة ، قم بقياس مستوى التلألؤ القاعدي للوحة لمرتين متتاليتين بمعدل 1000 مللي ثانية لكل بئر.
  12. قم بإزالة اللوحة بسرعة من قارئ اللوحة ، وأضف 25 ميكرولتر من تخفيف الرائحة إلى كل بئر ، وابدأ على الفور في قياس التلألؤ المستمر لجميع الآبار لمدة 20 دورة في غضون 30 دقيقة < / > ملاحظه: الماصة بعناية لتجنب تلويث الآبار المجاورة عند استخدام روائح مختلفة و / أو تركيزات مختلفة من نفس الروائح في نفس اللوحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMSO سيغما د2650 كاشف GloSensor cAMP بروميجا E1290 HBSS ، بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم جيبكو 14175095 هيبس هيكلون SH30237 المسكون سانتا كروز SC-200528 المسك التبتية سيجما ألدريتش S359165 PBS ، بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم سيلجرو 21-040-السيرة الذاتية أنبوب PCR 0.2 مل أكسايجن PCR-02-C أنبوب إيبندورف 1.5 مل إيبندورف 15 مل 17 مم × 120 مم أنبوب مخروطي بي دي فالكون 352096 8 آبار و / أو 12 بئر متعدد القنوات إيبندورف 96 بئر لوحة ثقافة الخلايا البيضاء ذات القاع المسطح غرينر 655098 طبق زراعة خلية 100 مم × 20 مم بي دي فالكون 353003 قارئ لوحة F200 اللانهائي تيكان

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

cAMP AMP

مقالات ذات صلة