Method Article

توصيف الفضاء خارج الخلية في شريحة دماغية باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات والرحلان الأيوني

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Odackal, J., et al. الرحلان الأيوني في الوقت الحقيقي مع رباعي ميثيل الأمونيوم لتحديد جزء الحجم والالتواء في الفضاء خارج الخلية في الدماغ. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو كيفية توصيف الفضاء خارج الخلية في شريحة دماغية باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات والرحلان الأيوني لقياس الإشارات الكهربائية ومقارنتها. تساعد هذه العملية في تحديد جزء حجم المساحة ودرجة الالتواء.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. الرحلان الأيوني في الوقت الحقيقي في شرائح الدماغ

  1. ضع شريحة دماغية بسمك 400 ميكرومتر في غرفة التسجيل ، مع التأكد من غمرها بالكامل في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المتدفق (ACSF). ضع الشريحة باستخدام فرشاة رسم بالألوان المائية وثبتها برفق بشبكة.
  2. حرك كل من القطب الكهربائي الأيوني و ISM فوق مجال الاهتمام على شريحة الدماغ. اغمر كلاهما في ACSF المتدفق ولكن فوق الشريحة.
  3. قم بإزاحة الجهد لكل من القنوات المرجعية وقنوات الاستشعار الأيونية إلى "0" مللي فولت. انتظر حتى يستقر الجهد في كلتا القناتين. على مسجل الرسم البياني ، حدد الجهد المقاس على قناة استشعار الأيونات الخاصة ب ISM. استخدم هذا لحساب المعلمة الأساسية V في Wanda.
  4. ضع القطب الصغير ISM والرحلان الأيوني بعمق 200 ميكرومتر في الشريحة وعلى بعد 120 ميكرومتر من بعضهما البعض. انتظر استقرار الإشارة بعد نقل القطب الصغير إلى شريحة الدماغ.
    ملاحظه: يتسبب تيار التحيز المطبق على القطب الكهربائي الأيوني في تراكم صغير لرباعي ميثيل الأمونيوم (TMA). من الخطأ الشائع أخذ تسجيل في وقت مبكر جدا والتقليل من تراكم الإشارة.
  5. على مسجل الرسم البياني ، ضع علامة على الجهد المستقر المقاس في شريحة الدماغ على قناة الاستشعار الأيوني ل ISM. احسب فرق الجهد بين إشارة TMA المقاسة في الخطوة 8.3 والخطوة 8.4 وأدخل هذه القيمة في حقل "خط الأساس V (mV)" في مربع قطب القياس الخاص بواجهة المستخدم الرسومية (GUI) من Wanda.
  6. على الجانب الأيسر من واجهة المستخدم الرسومية، تأكد من تسجيل/إدخال جميع المعلمات التجريبية بشكل صحيح. اضبط "متوسط" على "دماغ" ، و "رقم النقل" على متوسط القيمة المحسوبة للقطب الصغير للرحلان الأيوني في الخطوة 7.4 ، و "درجة الحرارة" على درجة حرارة الحمام الذي يحتوي على الشريحة.
    ملاحظة: يجب تسجيل V لكل مجموعة من القياسات. سيتم تحويل خط الأساس V بواسطة Wanda إلى معلمة خط الأساس C (mM) (أي تركيز TMA في أنسجة المخ).
  7. ابدأ التسجيل بالنقر فوق "اكتساب" واسمح له بتسجيل كامل. انتظر حتى تعود إشارة TMA إلى خط الأساس قبل الحصول على تسجيل جديد.
  8. خذ تسجيلين إلى ثلاثة تسجيلات متتالية قبل إزالة الأقطاب الكهربائية الدقيقة من موقع الدماغ المختار. أدخل درجة الحرارة المقاسة في برنامج Wanda مباشرة قبل كل تسجيل.
  9. حرك كلا القطبين الصغيرين قطريا إلى سطح الشريحة. ارفع كلاهما إلى 50 ميكرومتر على الأقل فوق الشريحة. باستخدام مسجل الرسم البياني ، حدد أي تغيير بين V المقاس الآن وقياسه من الخطوة 8.3.
  10. قم بتوسيط أطراف ISM والأقطاب الكهربائية الدقيقة الأيونية بالنسبة لبعضها البعض في المحاور x و y و z. احصل على تغييرات التباعد، إن وجدت، من شاشة صندوق التحكم في المعالجة الدقيقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments مكبر للصوت ل ISM داغان الموديل IX2-700 مضخم الصوت المزدوج داخل الخلايا مضخم الجهد الأيوني والمرجعي مع N = 0.1 (للبرميل المرجعي) و N = 0.001 (للبرميل الأيوني) منظار المركب البيولوجي (مع هدف 4x و 10x) لتقطيع أطراف الأقطاب الكهربائية الدقيقة وفحص الأقطاب الكهربائية الدقيقة ؛ موردين مختلفين ، على سبيل المثال AmScope أنابيب زجاجية شعرية من البورسليكات ثيتا جهاز هارفارد وارنر إنسترومنتس موديل TG200-4 ؛ طلب # 64-0811 أنابيب زجاجية مزدوجة الأسطوانة للأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات والأقطاب الكهربائية الدقيقة الأيونية ؛ OD 2.0 مم ، معرف 1.4 مم ، الحاجز 0.2 مم ، الطول 10 سم مسجل الرسم البياني لتسجيل الفولتية المستمرة على القطب الصغير الانتقائي للأيونات أثناء المعايرة في معايير رباعي ميثيل الأمونيوم وأثناء تجربة RTI ؛ على سبيل المثال مخطط Kipp & Zonen من النوع BD112 المزدوج المسجل ، متاح مجدد البرمجيات التجارية MathWorks MATLAB ، صندوق أدوات الحصول على البيانات للحصول على البيانات وتحليلها باستخدام برامج واندا ووالتر. لاحظ أن الرخصة الأكاديمية متاحة. نظارات واقية للعين صياد مجهر مركب ثابت المرحلة أوليمبوس BX51WI يمكن استخدام المجاهر المركبة الأخرى ذات المراحل الثابتة ملقط أدوات العلوم الدقيقة # 11251-10 لتقطيع الشعيرات الدموية الزجاجية. دوموند # 5 ، يفضل استخدامه ولم يعد هناك حاجة إليه للعمل الجيد وحدة الأيونية داغان أيون-100 وPS-100 ION-100 عبارة عن وحدة الرحلان الأيوني أحادية القناة +/- 130 فولت الامتثال ؛ PS-100 هو مصدر طاقة خارجي. البدائل: على سبيل المثال Axoprobe-1A المصنوع من Axon Instruments (الآن الأجهزة الجزيئية) ، خارج الإنتاج ، تحقق من توفر الوحدات التي تم تجديدها (eBay ومواقع أخرى) حامل القطب الكهربائي الصغير WPI M3301EH لعقد microeletrode الجاهزة الانتقائية للأيونات للسيلان وملء طرف البرميل الانتقائي للأيونات بمبادل أيوني سائل ؛ تبيع WPI نسختين من هذا الحامل ، M3301EH شفاف و M3301EH أسود. في تجربتنا ، يبدو أن M3301EH الواضحة أكثر ثباتا من M3301EH الأسود. مناور دقيق ناريشيجي مم -3 لوضع القطب الكهربائي الدقيق الانتقائي للأيونات الجاهزة أثناء السيلان وملء طرف البرميل الانتقائي للأيونات بمبادل أيوني سائل ؛ يمكن استبداله بأي مناور دقيق ثلاثي المحاور في حالة عمل جيدة الهدف 5x جاف أوليمبوس MPlan N الهدف 10x الغمر في الماء أوليمبوس UMPlan FL N الهدف 10x هو الغمر في الماء ، والفتحة العددية 0.3 ، ومسافة العمل 3.3 مم منصة ومرحلة ترجمة XY لمجهر المرحلة الثابتة إكسفو جبل طارق بيرلي منصة تحمل غرفة الشريحة ، ومعالجات دقيقة وملحقات ، والمرحلة الانتقالية XY تحرك المجهر دون المساس باستقرار التسجيل مناور دقيق آلي مع تحديد المواقع بدقة X و Y و Z أدوات سوتر النائب 285 هناك حاجة إلى اثنين من الميركوماني للاحتفاظ بشكل منفصل بالقطب الصغير الانتقائي للأيونات والقطب الكهربائي الأيوني. من الممكن أيضا لصق الماصات الدقيقة في مصفوفة متباعدة (انظر النص). وحدة تكييف الإشارة مع مرشح التمرير المنخفض أدوات محور CyberAmp 320 أو 380 لم يعد متاحا من الشركة المصنعة ولكنه قد يكون متاحا من E-Bay ؛ البدائل: على سبيل المثال مرشح / مكبر للصوت FLA-01 من Cygnus Technology. هذه أداة أحادية القناة مع حد أدنى للقطع عند 10 هرتز باستخدام مرشح Bessel متعدد الأقطاب ولكن قد تكون الشركة على استعداد لتعديله للحصول على تردد قطع أقل (2 هرتز) إذا لزم الأمر. الأسلاك الفضية أنظمة AM #7830 قطر 0.015 بوصة ، عارية (بدون طلاء) غرفة الشريحة جهاز هارفارد وارنر موديل RC-27L هذه هي غرفة شريحة الغمر. لا تستخدم غرفة شريحة الواجهة مجهر مجسمة للسيلان وملء طرف البرميل الانتقائي للأيونات بمبادل أيوني سائل ؛ شنت أفقيا ؛ موردين مختلفين كلوريد تيتراميثيامومونيوم (TMA) سيجما ألدريتش تي -3411 حل 5 م تنبيه: السمية الحادة (الفم ، الجلد ، الاستنشاق) ، السرطنة ، الخطرة على البيئة المائية ، راجع معلومات السلامة Sigma-Aldrich للحصول على الوصف الكامل

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular SpaceBrain SliceIon Selective MicroelectrodeIontophoresis MicroelectrodeTetramethylammoniumVolume FractionTortuosityArtificial Cerebrospinal FluidDual Channel ElectrodeSignal Recording

Related Articles