تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. الإجراء الجراحي
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تم حقن 20 فأرا من ذكور Sprague-Dawley ببروتين بيتا الأميلويد المركب (Aβ) في البطين الجانبي ونواة المهاد الأمامية وتم تصنيفها على أنها المجموعة المركبة المعالجة ب Aβ. تعرضت 20 فأرا أخرى لنفس العملية ولكنها تلقت 0.1٪ من الحقن المجهري للمحلول الملحي ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وتم تصنيفها على أنها المجموعة التي يتم تشغيلها بشكل زائف.
- تخدير الفئران بالأيزوفلوران بنسبة 100٪ عن طريق الاستنشاق ، ثم قم بتقييدها على جهاز تجسيمي في الدماغ.
- احلق الفراء على رأس الرأس بمقص جراحي وقم بتطهير اليودوفور. ثم قم بتغطية منشفة جراحية يمكن التخلص منها على الرأس.
- قم بعمل شق على جلد الرأس على طول الجلسنة الطولية المتوسطة باستخدام البيستوريات الجراحية والمقص.
- افصل الأنسجة تحت الجلد واللفافة ، وامسح كالفاريوم الجمجمة بقطن جاف معقم لوقف النزيف ، وقم بتمييز البريجما بقلم تحديد.
- ارجع إلى الخريطة التجسيمية لدماغ الفئران مع الأخذ في الاعتبار بريجما كنقطة المنشأ ، ضع علامة على النقاط الثلاث ، نواة المهاد الأمامية (ad) (الخلفية (P): 2.0 مم إلى البرجما ؛ الجانبية (L): 1.4 مم إلى خط الوسط) لحقن عامل النمو البشري المؤتلف المحول -β1 (RHTGF-β1) وتثبيت برغي واحد ، منطقة البطين الجانبي (LV) (الخلفي (P): 0.8 مم إلى البريجما. جانبي (L): 2.0 مم إلى خط الوسط) لحقن بروتين بيتا الأميلويد 25-35 (Aβ25-35) وثلاثي كلوريد الألومنيوم (AlCl3) ، ومكان التثبيت اللولبي الثاني (الأمامي (F): 2.0 مم إلى البريم ؛ الجانبي (L): 1.5 مم إلى خط الوسط).
- قم بحفر ثلاثة ثقوب قطرها 1 مم برفق باستخدام مثقاب عظمي مرن مخصص عند النقاط الثلاث المذكورة أعلاه من الجمجمة (1.5. خطوة). لا تقم بفك أعمق من اللازم لتجنب طعن أنسجة المخ.
- أوقف النزيف ونظف سطح الجمجمة بشكل متكرر باستخدام قطن جاف معقم.
- أدخل إبرة مرتبطة بمضخة الحقن المجهري في الدماغ على عمق 4.6 مم وحقن 1 ميكرولتر RHTGF-β1 (10 نانوغرام) برفق في منطقة الإعلان. ابق الإبرة لمدة 2 دقيقة بعد الحقن واسحب الإبرة ببطء.
- قم بتثبيت المسمارين في الجمجمة ، المحددة في نقاط الإعلان ، ومكان تثبيت المسمار الثاني للجمجمة (الذي تم تعيينه عند 1.5. خطوة) باستخدام مفك براغي صغير. لا تقم بفك أعمق من اللازم لتجنب طعن أنسجة المخ.
- قم بتجميع نظام زرع القنية وأدخل القنية الوهمية في قنية التوجيه بعد التطهير بالضغط العالي.
- أدخل قنية توجيه الأنابيب المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ في الدماغ عند 4.6 مم في منطقة الجهد المنخفض من خلال فتحة الجمجمة بمساعدة حامل القنية للجهاز التجسيمي للفئران.
- امزج المادة الأساسية لطقم الأسنان مع ماء قاعدة طقم الأسنان بنسبة 1.5 جم لكل 1 مل ، ضع المعجون لتغطية قاعدة القاعدة البلاستيكية لقنية التوجيه ، واثنين من المسمارين لتثبيت قنية التوجيه وتغطية شق الجلد بالكامل لتجنب عدوى الجلد.
- في اليوم الثاني من العملية ، تم تخدير الفئران باستنشاق الأيزوفلوران باستخدام آلة تخدير الصغيرة. اسحب القنية الوهمية ، وأدخل القنية الداخلية في قنية التوجيه ، وقم بلف برغي التثبيت لشل حركة القنية الداخلية.
- اضبط أنبوب البولي إيثيلين الذي يربط مضخة الحقن الدقيق بالقنية الداخلية وقم بتنظيم سرعة الحقن إلى 1 ميكرولتر / دقيقة.
- حقن دقيق 4 ميكروغرام (1 ميكرولتر) Aβ25-35 يوميا لمدة 14 يوما في الصباح و 3 ميكرولتر AlCl3 (1٪) يوميا لمدة 5 أيام بعد الظهر تحت تخدير الأيزوفلوران.
- انتظر 5 دقائق بعد الانتهاء من الحقن ، واسحب القنية الداخلية برفق ، وأدخل القنية الوهمية مرة أخرى في قنية التوجيه.
- في اليوم 15 ، بعد الجراحة (التي تتوافق مع آخر يوم حقن ل Aβ25-35) ، قم بتفكيك نظام زرع القنية. قم بإزالة مادة قاعدة طقم الأسنان برفق باستخدام المقص والملقط الجراحي ، وفك المسمارين ، واسحب قنية التوجيه ، وقم بتطهير الجرح بالبيتادين. املأ ثقب الجمجمة بالأسمنت العظمي وخياطة الجلد باستخدام طريقة خياطة متقطعة بسيطة.
- قم بإجراء نفس العملية باستخدام المجموعة التي يتم تشغيلها بالحائط الوهمي وحقن محلول ملحي DMSO بنسبة 0.1٪.
