إحداث الشلل في نموذج الفأر عن طريق نقل خلايا Th17 الخاصة ب Aquaporin-4

الملخص

المصدر: Sagan، S. A. et al.، تحريض الشلل وإصابة الجهاز البصري في الفئران بواسطة الخلايا التائية الخاصة بالتهاب النخاع والعصب البصري Autoantigen Aquaporin-4. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو إجراء إحداث الشلل عن طريق نقل خلايا Th17 المنشطة التي تستهدف أكوابورين -4 إلى نموذج فأر. في الجهاز العصبي المركزي ، تتفاعل خلايا Th17 المنشطة مع الخلايا النجمية التي تعبر عن الأكوابورين -4 ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية تؤدي إلى شلل الذيل والأطراف في الفأر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

تم شراء < p class = "jove_content" >C57BL / 6 (H-2^b) إناث الفئران ، التي تبلغ من العمر 8 أسابيع ، وتم توفير الفئران C57BL / 6 AQP4 ^{- / -} بواسطة A. Verkman.

فئة

1. تحصين الفئران بببتيدات AQP4

1. قم بإعداد مخزون عمل كامل لفرويند المساعد (CFA).​
   قم
   1. بطحن مستحضر مجفف من المتفطرة السلية (H37Ra) باستخدام الهاون والمدقة.
   2. أضف H37Ra المطحون إلى مساعد فرويند غير المكتمل إلى تركيز نهائي يبلغ 4 مجم / مل. يمكن تخزين CFA في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. قم بإذابة ببتيد المستضد المجفف بالتجميد (Ag) AQP4 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى تركيز نهائي يبلغ 1 مجم / مل. يحفظ عند 4 درجات مئوية أو على الثلج.
3. قم بإعداد مجموعة 2 من المحاقن ذات قفل اللور ، متصلة بمحبس محبس ، تحتوي على مستحلب CFA / الببتيد.
   1. قم بتوصيل حقنة زجاجية بقفل لور بدون مكبس بمحبس نايلون ثلاثي الاتجاهات مع 2 وصلات قفل لور. أغلق محبس عن طريق تبديل الرافعة باتجاه المحقنة. ضع الطرف المفتوح للحقنة لأعلى ، مما يسمح للحقنة بالعمل كأنبوب اختبار. ضع هذا في رف أنبوبي لمزيد من الاستقرار.
   2. دوامة مخزون عمل CFA وحل Ag. أضف حجما 1: 1 من الببتيد / CFA إلى المحقنة المفتوحة. مطلوب 200 ميكرولتر من CFA / Ag (4 × 50 ميكرولتر) لكل ماوس.
      ملاحظه: عادة ، يتم فقدان حوالي 1 مل من المستحضر في محبس التثبيت ، مما يقلل من الكمية المتاحة للتحصين. لذلك ، من المهم دمج هذا في حساب الحجم الإجمالي المطلوب.
      مثال: لتحصين 5 فئران: (200 ميكرولتر / × 5) + 1 مل حجم إضافي = 2 مل إجمالي CFA / Ag المطلوب.
   3. أدخل المكبس الزجاجي في المحقنة وأثناء تثبيته في مكانه ، اقلب المحقنة بحيث يتم توجيه المحبس لأعلى. قم بتبديل ذراع محبس التثبيت إلى الوصلة الأنثوية غير المستخدمة. اضغط بعناية على المكبس الزجاجي لإزالة الهواء الزائد من المحقنة. يملأ السائل وصلة قفل اللور الثانية للمحبس.
   4. قم بتوصيل حقنة زجاجية ثانية (مكبس يتم إدخاله بالكامل) بوصلة قفل اللور الثانية للمحبس. يجب أن يكون هذا نظاما مغلقا من 2 محاقن زجاجية متصلة بمحبس يحتوي على أقل قدر ممكن من الهواء الزائد.
   5. لعمل مستحلب ، امزج عن طريق دفع الغطاسات لتمرير السائل بالتناوب بين المحاقن لمدة دقيقتين تقريبا. قم بتبريد المحاقن على الثلج لمدة 10 دقائق تقريبا. كرر التبريد والخلط حتى يحدث تغيير واضح في لزوجة المستحضر ، مما ينتج عنه مستحلب أبيض شديد الصلابة. قم بتبريد المحاقن التي تحتوي على المستحلب عند 4 درجات مئوية أو حفظها على الثلج.
4. انقل كل المستحلب إلى حقنة زجاجية واحدة ذات قفل لور ، وقم بإزالة المحقنة الزجاجية الفارغة واستبدلها بحقنة قفل لور سعة 1 مل للحقن. املأ المحقنة الجديدة بالمستحلب ، ثم أخرجها من محبس التثبيت وقم بإرفاق إبرة (25 جم × 5/8).
5. "اختبار الماء" المستحلب من أجل الاتساق. طرد قطرة من المستحلب في طبق صغير من الماء. يجب ألا يتشتت المستحلب ، مما يشير إلى أنه مناسب للحقن.
   1. إذا تشتت المستحلب ، فهو غير جاهز للحقن ؛ انقل السائل مرة أخرى إلى المحاقن الزجاجية واستمر في الخلط ثم يبرد مرة أخرى حتى يصبح المستحلب صلبا.
   2. اختبر المستحلب مرة أخرى حتى يتحقق الاتساق المناسب.
6. حقن الفئران المانحة AQP4 ^تحت الجلد (s.c.) بمستحلب يحتوي على الببتيد AQP4. يتلقى كل فأر 4 × 50 ميكرولتر حقن s.c. (إجمالي 200 ميكرولتر (100 ميكروغرام من الببتيد)). تشمل المواقع الأربعة جانبي أسفل البطن ، والتي تستنزف في الغدد الليمفاوية الأربية (LN) ، وكلا جانبي جدار الصدر الإنسي لكل إبط ، والتي تستنزف في LN الإبطي. سيتطلب النقل بالتبني 1-2 فأر متبرع محصن لكل فأر متلقي.

فئة

2. ثقافة الخلايا التائية واستقطاب الخلايا التائية المسببة للالتهابات

1. بعد 10-12 يوما من التحصين ، اجمع LN من الفئران.
   1. في صينية ثلج ، قم بإعداد أطباق بتري مقاس 60 مم مزودة بمصفاة خلوية (حجم شبكة 70 ميكرومتر) وتحتوي على وسائط مبردة من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) مع مصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10٪ (FBS) و 100 وحدة / مل بنسلين -100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (بكتيريا القلم) (RFPS).
   2. القتل الرحيم للفئران عن طريق التعرض لثاني أكسيد الكربون₂ ، متبوعا بخلع عنق الرحم. اغمر الفئران في 70٪ من الإيثانول ثم قم بتثبيت كل وسادة قدم على لوحة التشريح.
   3. اقطع شق جلدي خط الوسط من الفخذ إلى الرقبة وأسفل كل ساق. اسحب الجلد بعيدا عن الصفاق وقم بتثبيته بإحكام على اللوحة. قم بتشريح LN الإربي والإبطي وضعه في طبق بتري الذي يحتوي على RFPS ، على الجليد.
   4. بالنسبة لتجارب نقل التبني ، اجمع بين LN من جميع داخل نفس مجموعة التحصين. لتحليلات قياس التدفق الخلوي لاستخدام Vβ ، افصل LN عن الفردية.
2. ضع مصفاة الخلية التي تحتوي على LN على أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على RFPS. استخدم الطرف المسطح لمكبس حقنة معقم سعة 5 مل للضغط على خلايا LN من خلال المصفاة ، وغسلها ب 20-30 مل من RFPS لتسهيل استعادة الخلايا. حافظ على خلايا LN على الجليد طوال المعالجة حتى وقت الزراعة.
3. يغسل مرتين ، مع الطرد المركزي عند 393 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق خلايا LN في وسائط الخلايا التائية (TCM). يحتوي الطب الصيني التقليدي على RPMI مع 10٪ FBS معطل حراريا ، و 292 ميكروغرام / مل من L-الجلوتامين ، و 110 ميكروغرام / مل بيروفات الصوديوم ، و 55 ميكرومتر 2-ميركابتو إيثانول وبكتيريا القلم. عادة ، يتم استخدام حجم 5 مل من TCM لكل فأر متبرع.
4. عد خلايا LAN. العائد المتوقع هو حوالي 3-6 × 10⁷ خلايا LN لكل متبرع بالفأر المحصن.
5. إعداد ثقافات مستقطبة لنقل التبني.
   1. قم بإعداد ثقافة استقطاب Th17 من 5 × 10⁶ خلايا LN لكل مل مع 10 ميكروغرام / مل Ag و 20 نانوغرام / مل إنترلوكين مؤتلف للفأر (IL) -23 و 10 نانوغرام / مل من الفأر المؤتلف IL-6 في الطب الصيني التقليدي.
   2. بدلا من ذلك ، من أجل استقطاب Th1 ، قم بإعداد مزرعة من 5 × 10⁶ خلايا LN لكل مل مع 10 ميكروغرام / مل Ag و 10 نانوغرام / مل من الفأر المؤتلف IL-12 في الطب الصيني التقليدي.
   3. أضف 2 مل (1 × 10⁷ خلايا) لكل بئر من خليط الثقافة المستقطب في طبق مكون من 12 بئرا. ستملأ خلايا LN من 2-4 فئران مانحة صفيحة واحدة مكونة من 12 بئرا. الحفاظ على المزارع في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة.
   4. تحقق بصريا من خلايا LN في الثقافة للتنشيط في 48 ساعة و 72 ساعة. ستشكل الخلايا المنشطة مجموعات واسعة وسيزداد حجم الخلايا التائية ، وتصبح أكثر تعدد الأشكال. ستؤدي الزيادة في التمثيل الغذائي إلى انخفاض درجة الحموضة في الوسائط ، والتغيير من الخوخ إلى البرتقالي. إذا كان الرقم الهيدروجيني منخفضا بما يكفي لتحويل الوسائط إلى اللون الأصفر ، أضف 1 مل من الطب الصيني التقليدي الطازج لمنع سمية الخلايا في ال 24 ساعة المتبقية.
   5. المضي قدما في نقل التبني.

< p class = "jove_title" >3. النقل بالتبني للخلايا التائية المسببة للأمراض الخاصة ب AQP4

ملاحظة: تتبع هذه الخطوة القسم 2.5: زراعة الخلايا التائية واستقطاب الخلايا التائية المسببة للالتهابات.

1. استرجع الخلايا المستقطبة من ألواح 12 بئرا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل لإزاحتها ، ونقلها إلى أنبوب سعة 50 مل. حافظ على الثلج حتى الحقن.
2. عد الخلايا ، واغسلها مرتين في PBS بارد ، وقم بإعداد تعليق 1 × 10⁸ خلايا / مل في PBS. بشكل عام ، حقن الخلايا في غضون ساعة.
3. امزج الخلايا برفق عن طريق تحريكها ونقلها إلى حقنة سعة 1 مل في وقت الحقن. قم بإدارة 200 ميكرولتر من الخلايا (2 × 10⁷) عن طريق الوريد (IV) لكل فأر ، من خلال الوريد الذيل.
4. حقن كل متلقي فأر i.p. مع 200 نانوغرام من B. السعال الديكي السم المخفف في 200 ميكرولتر من PBS في ذلك اليوم وبعد يومين. راقب الفئران يوميا بحثا عن علامات المرض السريري.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات M. السل H37Ra بي دي ديفكو 231141 م. السل المقتل مساعد فرويند غير مكتمل بي دي ديفكو هاتف: 263910 ببتيد AQP4 p135-153 جينميد التوليف المخصص تسلسل الببتيد: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN ببتيد AQP4 p201-220 جينميد التوليف المخصص تسلسل الببتيد: HLFAINYTGASMNPARSFGP ببتيد MOG p35-55 جينيميد / أوسبيب التوليف المخصص تسلسل الببتيد: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK 3-طريقة محبس كيمبل هاتف: 420163-4503 مصل HyClone Fetal Bovine (مميز) جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة SH30071 ماوس مؤتلف IL-23 أنظمة البحث والتطوير (BioTechne) 1887-مل ماوس مؤتلف IL-6 أنظمة البحث والتطوير (BioTechne) 406 مل ماوس مؤتلف IL-12 أنظمة البحث والتطوير (BioTechne) 419 مل السم السعال الديكي من B. السعال الديكي قائمة المختبرات البيولوجية 181 مضخة تمعجية متغيرة التدفق فيشر ساينتيك 13-876-2