تلطيخ الفلورسنت المناعي للخلايا العصبية في الجهاز الهضمي الفأري الجنيني

الملخص

المصدر: Barlow-Anacker ، A. J. ، et al. ، Immunostaining لتصور تطور الجهاز العصبي المعوي في الفئران. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو التلوين المناعي للجهاز الهضمي للفئران الجنينية لتصور وتحليل توزيع السكان العصبيين باستخدام التألق المناعي والفحص المجهري متحد البؤر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. بروتوكول التلوين المناعي

1. إذا تم تخزين العينات في 30٪ سكروز ، اشطفها 3 مرات لمدة 20 دقيقة في 1x PBS على منصة هزازة.
2. ضع المسالك GI في محلول الحجب على منصة هزاز لمدة 1 ساعة في RT.
3. قم بإزالة محلول الحجب واحتضان المسالك الهضمية بالكمية المناسبة من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب إما لمدة 4 ساعات عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية على منصة هزازة. استخدم تخفيفا بنسبة 1: 1,000 من الجسم المضاد البشري المضاد ل Hu (المصل الذي تم الحصول عليه من المريض) ، وتخفيف 1: 1,000 من الجسم المضاد للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، وتخفيف 1: 100 من الجسم المضاد للماعز المضاد ل ChAT.
   ملاحظه: نحن نستخدم جسما مضادا للإنسان المضاد ل Hu تم الحصول عليه محليا من مريض. ومع ذلك ، فإن الأجسام المضادة ل Hu متاحة تجاريا ، على سبيل المثال ، الفأر المضاد ل Hu (استخدم عند التخفيف 1: 500).
4. اشطف المسالك الهضمية في 1x PBS 3 مرات لمدة 5 دقائق ثم لمدة ساعة واحدة في RT على منصة هزازة.
5. استبدل 1x PBS بالأجسام المضادة الثانوية المخففة 1: 500 في محلول حجب على منصة هزاز إما لمدة 4 ساعات عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. استخدم صبغة حمير مضادة للإنسان مثل Dylight والحمار المضاد للدجاج Cy2 والحمار المضاد للماعز Cy5. إذا كنت تستخدم الجسم المضاد للفأر المضاد ل Hu ، فاستخدم مخففا بنسبة 1: 500 من صبغة حمير مضادة للفأر المضادة للأمين 405.
   ملاحظه: تزداد شدة تعبير GFP و tdTomato الداخلي ووضوح التلوين المناعي مع تقدم العمر في النمو. عادة ما نقوم بإزالة بقع الأحشاء الجنينية بشكل فردي في أنابيب 0.2 مل مع 150 ميكرولتر من محلول التلوين من أجل تقليل حجم الجسم المضاد المستخدم وأيضا لضمان تلطيخ الأنسجة بكفاءة.
6. اشطف المسالك الهضمية في 1x PBS 3 مرات لمدة 5 دقائق ثم لمدة ساعة واحدة في RT على منصة هزازة.
7. ضع بضع قطرات من وسط تركيب التألق باستخدام DAPI على شريحة زجاجية. اغمر جهاز الجهاز الهضمي في وسط تركيب التألق وأضف غطاء زجاجي مباشرة فوق المنديل. وسيط تركيب التألق -G هو مركب قابل للذوبان في الماء يوفر ختما شبه دائم.
   ملاحظه: استخدم وسيط تركيب مضان مثل Vectashield ، وهو وسيط تركيب قائم على الجلسرين يمنع تلاشي الأجسام المضادة والتبييض الضوئي. يتيح كلا المنتجين تخزين الأنسجة لفترات طويلة من الزمن عند 4 درجات مئوية.
8. التقط صورا لكل فلوروفور باستخدام مجهر متحد البؤر. استخدم الأطوال الموجية للإثارة للفلوروفورات والمرشحات المستخدمة في الجدول 1.
9. قم بإجراء تحليل للصور بمساعدة الكمبيوتر باستخدام البرامج المناسبة اعتمادا على نوع البؤر المتحد المستخدم لالتقاط الصور.

الجدول 1: الأطوال الموجية لإثارة التصوير متحد البؤر ، والفلوروفورات ، والمرشحات. يتم تقديم الأطوال الموجية للإثارة والفلوروفورات التي يمكن اكتشافها والمرشحات المستخدمة. يمكن استخدام هذه المعلومات في اختيار مجموعات من الأجسام المضادة الثانوية للتألق المناعي متعدد الألوان.

إثارة الانبعاثات خط الليزر نوع الفلوروفور امثله أنبوب مضاعف ضوئي خيارات التصفية 408 نانومتر أزرق Alexa Fluor 405 ، Cascade Blue ، Coumarin 30 ، DAPI ، Hoechst ، Pacific Blue ، معظم النقاط الكمومية 1 BP 425-475 نانومتر 488 نانومتر أخضر أليكسا فلور 488 ، ATTO 488 ، كالسين ، Cy2 ، eGFP ، FITC ، أوريغون جرين ، YO-PRO-1 2 BP 500-550 نانومتر 561 نانومتر أحمر Alexa Fluor 546 و 555 و 568 و 594 و Cy3 و DiI و DsRed و mCherry و Phycoerythrin (PE) و Propidium Iodine (PI) ، RFP ، TAMRA ، tdTomato، TRITC 3 BP 570-620 نانومتر 638 نانومتر أحمر بعيد أليكسا فلور 633 و 647 ، ألوفيكوسيانين (APC) ، Cy5 ، TO-PRO-3 4 BP 663-738 نانومتر

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول ملحي مخزن بالفوسفات أوكسويد BR0014G ألبومين مصل الأبقار صياد ص1605 تريتون X-100 سيغما X100 نطاق التألق نيكون مجسم SMZ-18 1.5 مل أنابيب Eppendorf VWR 20170-038 فلوروماونت-جي ساوثرن بيوتك ، برمنغهام ، أل 0100-01 شرائح زجاجية صياد 12-550-15 غطاء زجاجي VWR 16004-330 مجهر متحد البؤر نيكون نيكون A1 عناصر نيكون نيكون