التصوير بفاصل زمني لمراقبة الانتشار عبر الخلايا للبروتينات الشبيهة بالبريون في الديدان الخيطية المعدلة وراثيا

الملخص

المصدر: Nussbaum-Krammer ، C. I. ، et al. التحقيق في انتشار وسمية البروتينات الشبيهة بالبريون باستخدام الكائن الحي النموذجي ل Metazoan C. elegans. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو إجراء التصوير في الجسم الحي ل C. ايليجانس التي تعبر عن بروتينات شبيهة بالبريون الموسومة ببروتين الفلورسنت الأحمر. يتضمن البروتوكول تثبيت الديدان الخيطية على وسادة الاغاروز للفحص المجهري متحد البؤر بفاصل زمني ، مما يكشف عن تراكم البروتين ونقله داخل الخلايا وفيما بينها. هذه التقنية ضرورية لدراسة تراكم البروتين المرتبط بالأمراض التنكسية العصبية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. مراقبة الانتشار عبر الخلايا للبروتينات الشبيهة بالبريون عن طريق التصوير بفاصل زمني In Vivo

ملاحظة: تنمو C. ايليجانس من النوع البري (WT) (N2) والخطوط المعدلة وراثيا وفقا للطرق القياسية وتحكم بعناية في درجة حرارة الزراعة.

1. قم بإنشاء خطوط معدلة وراثيا من C. ايليجانس تعبر عن البروتين الشبيه بالبريون ، الموسوم ببروتين فلوري أحمر أحادي (mRFP).
2. تحضير مجموعات متزامنة عن طريق وضع البيض أو التبييض وفقا للطرق القياسية.
   1. التزامن عن طريق وضع البيض
      1. انقل 10-20 بالغا على طبق واتركهم يضعون البيض لمدة 1-2 ساعة.
   2. التزامن عن طريق التبييض
      1. اجمع مجموعة غير متزامنة من البالغين الحاملين وتبييضهم بمحلول هيبوكلوريت قلوي (250 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) و 1: 4 (حجم / حجم) تخفيف المبيض التجاري في الماء (H₂O)). اغسل البيض مرتين (218 × جم لمدة دقيقة واحدة) باستخدام M9 buffer (21 ملي مولار Na₂HPO₄ ·7H₂O (ثنائي فوسفات هيدروجين ثنائي الصوديوم هيبتاهيدرات) ، 22 ملي مولار (فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم) KH₂PO₄ ، 86 ملي كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 1 ملي ملي MgSO₄ ·7H₂O (سباعي كبريتات المغنيسيوم) ، أضف dH₂O حتى 1 لتر).
      2. اسمح لهم بالفقس في المخزن المؤقت M9 مع تحريك لطيف بين عشية وضحاها (O / N) عند 20 درجة مئوية ، وسيتم إيقاف تطور الدودة في المرحلة L1 في حالة عدم وجود مصدر غذائي ، مما يترك مجموعة سكانية متزامنة. انقل L1s إلى صفائح وسائط نمو الديدان الخيطية الطازجة (NGM) المصنفة ببكتيريا OP50 الإشريكية القولونية واترك النسل يتطور حتى العمر المطلوب.
3. تحضير 2٪ وسادات الاغاروز (في H₂O) على شريحة مجهرية كما هو موضح.
   1. قم بإعداد شريحتين مجهريين مع وضع شريط لاصق على طولهما بالكامل لاستخدامهما كفواصل للفواصل ضع شريحة مجهر ثالثة بينهما.
   2. قم بإذابة 2٪ من الاغاروز في H₂O وقم بوضع قطرة واحدة على الشريحة النظيفة.
   3. ضع شريحة رابعة عموديا على الشرائح الثلاث الأخرى أعلى قطرة الأجار. اضغط عليه برفق لأسفل لتسطيح الوسادة بنفس سمك شريط الملصق.
   4. اتركه يجف لمدة 1 دقيقة قبل إزالة الفواصل وسحب الشرائح برفق. سوف تلتصق وسادة أجار بأحدها.
4. ماصة ~ 10 ميكرولتر مخدر (2 ملي ليفاميسول في المخزن المؤقت M9) إلى الوسادة ونقل ~ 10 باستخدام معول سلك بلاتيني. قم بتغطيتها بزلة غطاء (~ 22 × 22 مم) والتقط الصور في غضون ساعة واحدة.
5. بدلا من ذلك ، للحصول على الأفلام على مدى فترة زمنية أطول أو لتقليل احتمالية أي حركة للحيوانات ، استخدم مزيجا من التخدير وتثبيت الخرز.
   1. قم بإعداد وسادات الاغاروز بنسبة 10٪ (في المخزن المؤقت M9) كما هو موضح وأضف الديدان إلى محلول معايير حجم الكرة النانوية 3 ميكرولتر (حبات البوليسترين ، 100 نانومتر) بالإضافة إلى 3 ميكرولتر مخدر (4 ملي ليفاميسول في المخزن المؤقت M9). غطيها برفق مع زلة غطاء. لتجنب الجفاف ، أغلق الغطاء باستخدام VALAP (خليط من كميات متساوية من الفازلين واللانولين وشمع البارافين).
6. صور الديدان المجمدة باستخدام مجهر متحد البؤر.
   ملاحظة: يتم الحصول على النتائج باستخدام مجهر متحد البؤر AF للقرص الدوار المجهز بكاميرا EM-CCD وأتمتة الفحص المجهري وبرنامج تحليل الصور مثل MetaMorph الذي يحدد التفاصيل أدناه ، ولكن يمكن أيضا استخدام أنظمة تصوير متحد البؤر الأخرى المماثلة.
   1. استخدم هدف الزيت 63X أو 100X / 1.4NA وضع شريحة المجهر التي تحتوي على ديدان في حامل شريحة المجهر.
   2. افتح البرنامج. اضبط طاقة الليزر والمرشحات لتصوير mRFP. استخدم ليزر 561 نانومتر بقدرة 10٪ ومرشح انبعاث >600 نانومتر.
   3. افتح "الاستحواذ متعدد الأبعاد". ضمن علامة التبويب "الرئيسية"، حدد مربعات "اللقطات المتتابعة" و"تشغيل المجلات" (التركيز التلقائي للأجهزة: إيقاف).
   4. ضمن علامة التبويب "حفظ" ، حدد أو أنشئ مجلد الدليل حيث يجب حفظ الملفات. قم بتعيين اسم للملف.
   5. ضمن علامة التبويب "طول الموجة" ، حدد الإضاءة المناسبة واضبط التعريض الضوئي والكسب. استخدم "YokoQuad Red" (أو إعداد إضاءة مكافئ لتصوير mRFP) مع تعريض يتراوح بين 100 و 300 مللي ثانية وكسب الكاميرا بين 100 و 300 ، اعتمادا على العينة الفردية (التي تم تقييمها باستخدام الصورة الحية).
   6. ضمن علامة التبويب "الفاصل الزمني" ، حدد "عدد النقاط الزمنية" = 301 ، و "المدة" = 5 دقائق ، و "الوقت / الفاصل الزمني" = 1 ثانية.
   7. ضمن علامة التبويب "اليوميات"، حدد دفتر اليومية: "AFC SET Z HOLD" و "AFC Return to Z HOLD"، اكتب: "خاص" (مرتين)، النقطة الأولية: "بداية النقطة الزمنية" و "نهاية النقطة الزمنية". يعد خيار التركيز البؤري التلقائي هذا مهما لتصوير نفس القسم على مدى فترة زمنية أطول.
   8. عند اكتمال الإعداد ، اضغط على "اكتساب". يتم حفظ فيديو الفاصل الزمني كملفات TIFF منفصلة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكاشف معايير حجم الكرة النانوية 100 نانومتر العلم الحراري 3100 أ ليفاميزول سيغما L-9756 معدات جهاز طرد مركزي مبرد سورفال ليجند XTR ، 120 فولت تيار متردد العلم الحراري 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120< / > تيار متردد / EW-17707-60 96 دبوس النسخ المتماثل Scionomix http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ شاكر احتضان عالي السعة HiGro ديجيلاب http://www.digilabglobal.com/higro موزع كاشف كومبي متعدد القطرات تيتريك http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm محطة العمل الآلية Biomek FX AP96 بيكمان كولتر http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm شاكر Innova44 نيو برونزويك http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04 & الإجراء = المنتجات & ContentID = 1 &
الكتالوج = 83389 M205 FA لايكا http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ ORCA-R2 C10600-10Bكاميرا CCD رائعة هاماماتسو http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html مجهر متحد البؤر التلقائي للقرص الدوار لايكا http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ كاميرا فالكون 4M60 تيليدين دالسا http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ برمجيات برنامج أتمتة الفحص المجهري MetaMorph وتحليل الصور الأجهزة الجزيئية http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html برنامج تحليل الصور Hamamatsu SimplePCI ماير إنسترومنتس http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm إيمج جيه المؤسسه http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html البرنامج المساعد wrMTrck ل ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html C. سلالات ايليجانس N2 (الوزن الوزني) مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570