$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. إنتاج وتنقية الفيروس المرتبط بالغدة المؤتلفة (rAAV)
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تم إجراء إنتاج وتنقية نواقل rAAV بواسطة نواة الناقل الفيروسي Leuven (LVVC).
- باختصار ، يتم استخدام خلايا HEK 293T المتصقة بمرور منخفض التقاء (<50) باستخدام محلول تعداء بولي إيثيلينيمين خطي 25 كيلو دالتون 150 نانومتر وثلاثة بلازميدات مختلفة بنسبة 1: 1: 1 في مصل بقري الجنين المتوسط DMEM 2٪. بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، استبدل الوسط بمصل بقري جنيني متوسط DMEM طازج.
ملاحظه: تشتمل البلازميدات على تركيبات النمط المصلي AAV7 ، وبلازميد نقل AAV الذي يشفر آلفا سينوكلين الطافرة البشرية A53T (α-SYN) تحت سيطرة محفز synapsin1 المحسن CMVie ، وبلازميد مساعد الفيروسات الغدية pAdvDeltaF6.
- احصد الوسط بعد 5 أيام من التعداء العابر والتركيز باستخدام ترشيح التدفق العرضي.
- قم بتنقية جزيئات متجهات rAAV من الوسط المركز باستخدام تدرج خطوة يوديكسانول.
- استخدم التقنيات القياسية لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لتحديد النسخة الجينومية (GC). في هذا البروتوكول ، تم استخدام عيار ناقل يبلغ 3.0 E11 GC / ml لتطوير نموذج فئران قائم على α-SYN لمرض باركنسون (PD).
< p class = "jove_title" >
2. الحقن التجسيمي ل rAAV α-SYN Vector في المادة السوداء (SN) للجرذ (الشكل 1)
- قم بإسكان أنثى فئران ويستار البالغة من العمر ثمانية أسابيع والتي تزن حوالي 200-250 جراما في ظل دورة إضاءة / مظلمة عادية مدتها 12 ساعة مع حرية الوصول إلى الطعام المحبب وماء الصنبور.
- يتم إرسال الجرذ للتخدير داخل الصفاق (IP) الذي يحتوي على خليط من الكيتامين (60 ملغ/كغ) وميديتوميدين (0.4 ملغ/كغ). بمجرد تخدير الجرذ ولا يتفاعل عند الضغط على الكفوف المختلفة ، قم بإعطاء جهاز إرسال واستقبال دقيق تحت الجلد على الجزء الخلفي من الجرذ لمزيد من التعرف عليه باستخدام جهاز زرع جهاز الإرسال والاستقبال الدقيق. تحقق مما إذا كان جهاز الإرسال والاستقبال الصغير قد تم وضعه بشكل صحيح ويمكن قراءته بواسطة جهاز القراءة.
- قص الشعر فوق فروة الرأس. ضع مخدرا موضعيا على كل من فروة الرأس والأذنين. قم بإجراء بقية العملية الجراحية تحت التدفق الرقائقي باستخدام تقنيات معقمة.
- ضع الفئران في إطار رأس تجسيمي باستخدام قضيبين للأذن وفم وقضيب أنف. قم بتغطية جسم الجرذ ببطانية ورقية لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. ضع مادة تشحيم العين لمنع جفاف العينين.
- تطهير فروة الرأس بالجوديوم 1٪ في الأيزوبروبانول 70٪ وعمل شق صغير في خط الوسط لفروة الرأس. اكشطي الأغشية الموجودة على الجمجمة برفق واشطفيها بالمحلول الملحي. دع الجمجمة تجف لعدة دقائق. راقب خيوط الجمجمة والنقطتين المرجعيتين: Bregma و Lambda.
- لحقن متجه rAAV في SN ، حدد الإحداثيات نحو Bregma (الأمامي الخلفي: 5.3 مم ؛ الوسطي الجانبي: 2.0 مم ؛ والظهري البطني: 7.2 مم محسوبة من الجافة).
ملاحظه: يمكن حساب الإحداثيات ثلاثية الأبعاد لكل منطقة ذات أهمية باستخدام أطلس تجسيمي لدماغ الفئران ، مع تطبيق Bregma كنقطة مرجعية تشريحية.
- املأ حقنة حقن مجهرية سعة 10 ميكرولتر (مقياس 30 20 مم) بناقل rAAV وضعها في أداة الحقن المجسمة المتصلة بمضخة حقن دقيقة آلية. تحكم في الحجم عن طريق إطلاق قطرة من المتجه والتخلص من منظف التنظيف متعدد التكافؤ درجة الحموضة 9 (مثل RBS).
- تحقق بصريا مما إذا كان الرأس مثبتا بشكل مستقيم في إطار الرأس وقم بتقييم المحور الأيمن الأيسار. حدد بصريا الإحداثيات الأمامية الخلفية والمتوسطة الجانبية ل Bregma و Lambda وقم بقياس ارتفاعها باستخدام إبرة قياس 30 مم 20 مم في الذراع الظهرية البطنية للإطار التجسيمي.
- اسمح باختلاف الارتفاع بحد أقصى 0.3 مم بين بريجما ولامدا. ضع الإبرة مرة أخرى على بريجما وقم بتطبيق الإحداثيات الأمامية الخلفية والمتوسطة الجانبية عن طريق تحريك الذراع الأمامي الخلفي والذراع الوسطي الجانبي للإطار التجسيمي.
- في مكان الحقن ، قم بقياس ارتفاع الجمجمة وتأكد من أنها لا تختلف أكثر من 0.3 مم عن ارتفاع Bregma. حفر ثقب في الجمجمة بقطر 2 مم تقريبا. قم بقياس ارتفاع الجافية ، والتي ستكون بمثابة مرجع لتطبيق الإحداثي الظهري البطني. بدلا من ذلك ، اطرح سماكة ثابتة للجمجمة (0.9 مم).
- اخترق الجافية باستخدام إبرة قياس 26 وامتصاص الدم بأنسجة معقمة. انتظر حتى يتوقف كل النزيف قبل المتابعة.
- أدخل ببطء حقنة الحقن المجهري سعة 10 ميكرولتر المحملة مسبقا بمحلول ناقل في الدماغ إلى العمق المحدد مسبقا (الإحداثيات الظهرية البطنية). انتظر 1 دقيقة مع وضع الإبرة في مكانها. حقن 3 ميكرولتر من محلول الناقل (3.0 نسخ جينوم E11 / مل (جرعة ناقلة متوسطة) أو 1.0 E12 GC / مل (جرعة ناقلة عالية) من ناقل التحكم rAAV2 / 7 α-SYN أو eGFP) باستخدام مضخة الحقن المجهري الآلية بإنتاجية 0.25 ميكرولتر / دقيقة.
- بعد الحقن ، احتفظ بالإبرة في مكانها لمدة 5 دقائق أخرى قبل إزالتها ببطء. قم بغرز فروة الرأس باستخدام البوليستر المضفر المطلي 3.0 ، وقم بتطهير 1٪ جوديوم في 70٪ من الأيزوبروبانول وإزالة برفق من الأداة التجسيمية. قم أولا بفك شريط الأنف والفم ، ثم قضيبتي الأذن.
- لعكس التخدير ، حقن الجرذ داخل الصفاق ب 0.5 مجم / كجم من الأتيبامزول وضع الجرذ في قفص نظيف على لوح تسخين بدرجة حرارة 38 درجة مئوية حتى يستيقظ. غطي الجرذ ببطانية ورقية لمنع انخفاض درجة حرارة الجسم.
- توفير سهولة الوصول إلى الطعام والماء في الساعات الأولى. راقب الجرذ في الأيام القليلة الأولى. إذا لزم الأمر ، ضع تسكين.
ملاحظه: ليست هناك حاجة لإزالة الغرز من الجمجمة. بعد 1-2 أسابيع ، يتم إصلاح الجمجمة بالكامل ، وتفقد الغرز.
