مقالة منهجية

عزل مجاميع البروتين غير القابلة للذوبان في المنظفات من أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Diner، I.، et al. إثراء مجاميع البروتين غير القابلة للذوبان في المنظفات من دماغ ما بعد الوفاة البشري. J. Vis. Exp. (2017).

يشرح هذا الفيديو عملية عزل وإثراء مجاميع البروتين غير القابلة للذوبان في المنظفات من أنسجة المخ البشري المجمدة بعد الوفاة. يوضح الخطوات الرئيسية ، بما في ذلك التجانس ، ومعالجة المنظفات ، والصوتنة ، والطرد المركزي الفائق لفصل وتنقية الركام غير القابل للذوبان. تتضمن الخطوة الأخيرة إذابة الركام في مخزن اليوريا لمزيد من التحليل.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. التجانس والتجزئة

  1. اختيار الأنسجة
    ملاحظة:     تم اختيار أنسجة القشرة الأمامية المجمدة بعد الوفاة من المراقبة الصحية (Ctl) وحالات مرض الزهايمر المؤكدة مرضيا (ن = 2). تم إجراء التقييم العصبي المرضي بعد الوفاة لتوزيع لويحات الأميلويد وفقا لمعايير التسجيل شبه الكمية لاتحاد إنشاء سجل لمرض الزهايمر ، على الرغم من تقييم أمراض التشابك الليفي العصبي وفقا لنظام التدريج براك.
    1. الحصول على أنسجة المخ المجمدة بعد الوفاة من المراقبة الصحية (Ctl) وحالات مرض الزهايمر المؤكدة مرضيا. باستخدام حاويات من الثلج الجاف والملقط وشفرة الحلاقة ، استقر ~ 250 مجم من أجزاء المادة الرمادية من كل عينة من الأنسجة على قوارب الوزن التي تستخدم لمرة واحدة ، مع الحرص على منع ذوبان الأنسجة. سجل وزن كل قطعة المراد تجانسها.
    2. استكشاف ~ 250 مجم من المادة الرمادية باستخدام الملقط وشفرة الحلاقة عن طريق الفحص البصري لتحديد موقع الواجهة بين المادة الرمادية الخارجية والمادة البيضاء الداخلية. تجنب المادة البيضاء والأهم من ذلك ، أي أوعية دموية كبيرة أو مناطق دموية أو سحايا أو أم عنكبوتية. حافظ على تجميد الأنسجة أثناء عملية القطع من خلال العمل بسرعة وبشكل متكرر في وضع قارب الوزن مع أنسجة المخ في حاويات البوليسترين مع الثلج الجاف.
    3. سجل الوزن الدقيق للمادة الرمادية المستقاة من كل قطعة مجمدة باستخدام ميزان تحليلي. احسب حجم المخزن المؤقت منخفض الملح (LS) (انظر الجدول 1) اللازم لتجانس الهبوط (5 مل / جم أو 20٪ وزن / حجم).
    4. قم بإعداد 10 مل من المخزن المؤقت LS مع 1x كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز واتركه يبرد على الثلج.
    5. قم بإزالة المناديل الموزونة وقارب الوزن من الثلج الجاف وقم بتقطيعه إلى قطع 2 × 2 مم تقريبا أثناء ذوبانها. انقله إلى أنبوب الخالط المبرد مسبقا سعة 2 مل على الثلج.
    6. أضف 5 مل / جم (20٪ وزن / حجم) من المحلول المؤقتة منخفضة الملح المثلج (LS) مع كوكتيل 1X البروتياز ومثبط الفوسفاتيز.
    7. قم بتجانس أنسجة المخ على الجليد باستخدام ما يقرب من 10 ضربات من المدقة عالية الخلوص A و 15 ضربة من المدقة منخفضة الخلوص B.
    8. انقل كل المتجانسات إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 2 مل باستخدام ماصة باستور زجاجية. قم بتسمية الأنبوب ب "TH" (التجانس الكلي) ، ورقم علبة الأنسجة ، والحجم المتجانس. Aliquot 0.8 مل في أنبوب 1.5 مل مسمى. يمكن بالمثل أن يتم تقسيم أي تجانس زائد وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
    9. إلى كل 0.8 مل من الكمية ، أضف 100 ميكرولتر لكل من 5 M كلوريد الصوديوم و 10٪ (وزن / حجم) ساركوسيل إلى تركيزات 0.5 م و 1٪ وزن / حجم ، على التوالي. امزج الأنابيب جيدا عن طريق الانعكاس واحتضانها على الثلج لمدة 15 دقيقة. تسمية الأنابيب مع "TH-S" (المتجانس الكلي ساركوسيل) للإشارة إلى أن المتجانسات في sarkosyl-buffer (الجدول 1).
    10. قم بإجراء صوتيات لكل أنبوب لثلاث نبضات 5 ثوان بسعة 30٪ على الجليد (أقصى كثافة = 40٪) باستخدام مسبار microtip.
    11. تحديد تركيزات البروتين في المتجانسات باستخدام طريقة فحص حمض البيسنكونينيك (BCA).
      ملاحظه: متوسط تركيز البروتين لمجانسات TH-S المحضرة عند 5 مل LS لكل جرام من الأنسجة هو 15-20 مجم / مل. يمكن تجزئة المتجانسات على الفور أو تخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    12. يخفف TH-S يتجانس إلى 10 مجم / مل باستخدام عازلة سارك المثلجة الباردة (الجدول 1) مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز 1x.
    13. نقل 5 مجم بروتين (0.5 مل) من كل متجانس TH-S إلى 500 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي الفائق من البولي كربونات والتوازن الزوجي مع عازلة سارك. قم بتحميل الأنابيب في دوار مبرد مسبقا وجهاز طرد مركزي فائق عند 180،000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المواد الطافية القابلة للذوبان في الساركوزيل (S1) إلى أنابيب 1.5 مل وتخزينها عند -80 درجة مئوية
      ملاحظة: (غسيل اختياري) أضف 200 ميكرولتر من عازلة سارك إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة التي تحتوي على الأجزاء غير القابلة للذوبان في المنظفات (P1) وقم بإزاحة الكريات (P1) من أسفل أنابيب الطرد المركزي الفائق باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر.
      14. قم
    14. بتدوير الأنابيب المقلوبة لفترة وجيزة لمدة 2-3 ثوان (≤2,500 × جم) على جهاز طرد مركزي دقيق لنقل الكريات (P1) والتخزين المؤقت إلى أنابيب 1.5 مل أدناه. أعد تعليق الكريات غير القابلة للذوبان (P1) في المخزن المؤقت عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل لضمان تعطل الحبيبات.
    15. توازن الزوج ، وجهاز الطرد المركزي عند 180,000 × جم لمدة 30 دقيقة إضافية عند 4 درجات مئوية.
    16. تخلص من المادة الطافية الاختيارية للغسيل (S2) واحتضان الكريات غير القابلة للذوبان في الساركوسيل (P2) في 50-75 ميكرولتر من محلول اليوريا (الجدول 1) مع 1x PIC (كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإذابة الحبيبات.
      ملاحظه: قم بتسخين اليوريا إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام لتجنب هطول الأمطار SDS. بالنسبة للتطبيقات الحساسة للمنظفات ، احذف SDS من عازلة اليوريا وفكر في غسل الحبيبات غير القابلة للذوبان (P2) في محلول منخفض الملح قبل إعادة تعليقها في محلول اليوريا.
    17. نقل الكريات المعلقة (P2) إلى 0.5 مل أنابيب واستخدام موجز (1 ثانية) صوتنة microtip في 20٪ السعة (الكثافة القصوى = 40٪) لإذابة الكريات تماما.
    18. تحديد تركيزات البروتين للكسور القابلة للذوبان في الساركوسيل (S1) وغير القابلة للذوبان (P2) باستخدام طريقة فحص BCA. استخدم هذه الكسور على الفور أو خزنها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة

10٪ وزن / حجم محلول ساركوسيل: 10 جم ملح الصوديوم N-lauryl-sarcosine لكل 100 مل من ddH2O (يقلب في RT طوال الليل) المخزن المؤقت منخفض الملح (LS): 50 ملي مولار هيبس الرقم الهيدروجيني 7.0 ، 250 ملي سكروز ، 1 ملي مولار EDTA المخزن المؤقت Sarkosyl (sark): مخزن LS + 1٪ (وزن / حجم) Sarkosyl + 0.5 M كلوريد الصوديوم مخزن اليوريا المؤقت (يحفظ عند -20 درجة مئوية): 50 ملي درجة الحموضة Tris-HCl 8.5 ، 8M اليوريا ، 2٪ SDS

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز ، خال من EDTA (100X) ثيرمو فيشر 78441 كوكتيل مثبطات البروتياز والفوسفاتيز نظام المزيل الصوتي (الموجات فوق الصوتية) فيشر ساينتيك FB505110 ميكروتيب الموجات فوق الصوتية جهاز الطرد المركزي الفائق Optimax TLX بيكمان كولتر 361545 جهاز طرد مركزي فائق المبرد دوار TLA120.1 بيكمان كولتر 362224 دوار الطرد المركزي الفائق 500 ul (8x34mm) أنابيب البولي كربونات ، سميكال بيكمان كولتر 343776 أنابيب الطرد المركزي الفائق للدوار TLA120.1 ملح الصوديوم N-Lauroylsarcosine (sarkosyl) سيجما ألدريتش L5777-50G منظف 1.5 مل بولي بروبلين بيليه مدقة كيمبل تشيس 749521-1500 أداة التجانس محرك لاسلكي ل Pellet Pestle كيمبل تشيس 749540-0000 أداة التجانس

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BCA

مقالات ذات صلة