Method Article

تقييم الوظيفة الحركية في نموذج الفأر التجريبي لالتهاب العصب المناعي الذاتي

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Gonsalvez ، D. G. ، et al. ، نهج بسيط للحث على التهاب العصب المناعي الذاتي التجريبي في الفئران C57BL / 6 للتقييمات الوظيفية والمرضية العصبية. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو عملية تقييم الخلل الحركي في نموذج الفأر من خلال إعطاء سم السعال الديكي ولقاح يحتوي على الببتيدات والمواد المساعدة التي تحاكي المايلين ، تليها اختبارات جهاز المشي لتقييم الوظيفة الحركية وتقييم تلف الأعصاب الناتج بسبب التنشيط المناعي وإزالة الميالين.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحريض EAN (التهاب العصب المناعي الذاتي التجريبي)

ملاحظة: يمكن تحفيز EAN بنجاح في ذكور C57BL / 6 الفئران التي تتراوح أعمارها بين 6-8 أسابيع. يستغرق بروتوكول الحث 9 أيام في المجموع. يشير اليوم 0 إلى يوم التحصين الأول. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم إجراء الحقن تحت التخدير (انظر الخطوة 1.1.2 أدناه).

  1. في اليوم -1:
    1. تحضير محلول سم السعال الديكي (انظر جدول المواد) بحجم 1.6 ميكروغرام / مل باستخدام محلول ملحي معقم 0.1 متر من الفوسفات متساوي التوتر (MT-PBS).
    2. التخدير بالأيزوفلوران:
      1. ضع الماوس (C57BL / 6 ، ذكر ، 6-8 أسابيع) في غرفة التخدير واضبط تدفق الأكسجين على 1 لتر / دقيقة.
      2. قم بتشغيل مبخر الأيزوفلوران ، واضبطه على 2.5٪ للتخدير ، وراقب التنفس ، وانتظر لمدة دقيقتين أو حتى لا تستجيب ردود الفعل الأولية (القرنية والطرف الخلفي).
    3. أخرج الماوس من غرفة التخدير وقم بإعطاء 250 ميكرولتر من محلول السموم السعال الديكي أعلاه عن طريق حقن داخل الصفاق (IP) باستخدام حقنة 0.5 مل بإبرة 301/2 جم.
    4. تحضير اللقاح عن طريق الحقن للتحصين:
      1. تحضير المحلول A باستخدام محلول 2 مجم / مل من الببتيد P0180-199 (مع نقاء > 98٪ ، تسلسل S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) في محلول ملحي 0.9٪.
      2. تحضير المحلول B باستخدام محلول 20 ملغم/مل من المتفطرة السلية (انظر جدول المواد) في مادة مساعدة فرويند الكاملة (FCA، تتكون من 15٪ أحادي مانيد + 85٪ زيت بارافين و 0.5 ملغم/مل من المتفطرة الزبدية المجففة والمجففة).
      3. لعمل اللقاح النهائي للحقن ، امزج أجزاء متساوية الحجم من المحاليل A و B في مضرب حبة واخلطها بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بالمحاليل A و B كمخزون وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد كحد أقصى ، ولكن يجب تحضير اللقاح النهائي المركب حديثا في يوم حقن الفأر.
  2. في اليوم 0، قم بإعطاء 50 ميكرولتر من اللقاح (المستحضر الموضح في الخطوة 1.1.4) في الفأر عن طريق حقنة تحت الجلد باستخدام إبرة 23 جم.
    ملاحظه: يمكن وضع الحقن بين لوحي الكتف أو بين الطرف الخلفي والذيل فوق الظهر الذيلي.
  3. في اليوم الأول ، اصنع محلول السموم السعال الديكي بحجم 1.2 ميكروغرام / مل (في MT-PBS) وقم بإعطاء 250 ميكرولتر في الماوس عن طريق حقن IPS باستخدام حقنة 0.5 مل بإبرة 301/2 G.
  4. في اليوم 3 ، كرر الخطوة 1.3 أعلاه.
    ملاحظه: يمكن صنع محاليل المخزون A و B وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد كحد أقصى. ومع ذلك ، يجب أن يتم اللقاح النهائي عن طريق الحقن ، الناتج عن طريق الجمع بين المحاليل A و B ، في يوم الحقن.
  5. في اليوم 8، قم بإعطاء 50 ميكرولتر من اللقاح (المستحضر الموضح في الخطوة 1.1.4) في الفأر عن طريق الحقن تحت الجلد (انظر الخطوة 1.2 أعلاه) في نفس موقع الحقن كما في الخطوة 1.2 (لكل)
فئة

2. تقييم الوظيفة الحركية

ملاحظة: يتم تقييم الأداء الحركي بالتوازي مع التسجيل السريري لنفس المجموعة من. يجب توصيل جهاز تقييم الوظيفة الحركية بجهاز كمبيوتر مثبت عليه نظام تصوير وظيفة المشي (انظر جدول المواد). يوصى أيضا بتعويد جميع الفئران المراد تقييمها على مهمة التشغيل قبل تحريض EAN. للقيام بذلك ، يتم إجراء عمليات الممارسة (2 اختبار لكل فأر) قبل ثلاثة أيام من تحريض المرض (اليوم -3).

  1. قم بتشغيل جهاز تقييم وظيفة المحرك وقم بتشغيل زر الضوء.
    2. قم
  2. بتقطيع الماوس بقوة وحبر قدميه عن طريق إنزاله على وعاء مملوء بالحبر الأحمر أثناء الإمساك بذيله.
    ملاحظه: هذه الخطوة مطلوبة لسلالة C57BL / 6 ولكن يمكن تخطيها إذا تم استخدام سلالة ماوس بلون طبقة بيضاء.
  3. ضع الماوس في حجرة المشي واضبط سرعة جهاز المشي على 15 سم / ثانية.
  4. قم بتشغيل جهاز المشي وانقر فوق الزر "تسجيل" لالتقاط حركة تشغيل الماوس باستخدام نظام تصوير وظيفة المشي (انظر جدول المواد).
  5. استخدم مؤقتا وقم بقياس كل تشغيل لمدة 36 ثانية. بعد 36 ثانية ، توقف عن التسجيل وأوقف جهاز المشي.
    ملاحظه: تعتبر الفئران التي لا يمكنها إكمال المهمة قيد التشغيل بنجاح لهذا الفاصل الزمني البالغ 36 ثانية قد فشلت.
  6. احفظ ملف الفيديو في المجلد المخصص.
  7. كرر الخطوات المذكورة أعلاه ليتم تقييم كل ماوس. اختبر الفئران بنفس مهمة التشغيل كل 3 أيام.
  8. قم بتحليل ملفات الفيديو التي تم تحريرها باستخدام برنامج لمعلمات وظيفة المشي (انظر جدول المواد).
    ملاحظه: تختلف تفاصيل كيفية تحليل معلمات المحرك المختلفة بين البرامج ، لذا يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة قبل التحليل. اعتمادا على الأهداف المحددة للبحث ، يمكن أخذ الأنسجة الحيوانية في أي مرحلة من مراحل تقييم وظيفة ما بعد الحركة للحصول على دليل نسيجي على تلف المحور العصبي والمايلين إما عن طريق الكيمياء المناعية أو المجهر الإلكتروني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجدول 1: نموذج النتيجة السريرية EAN.

نقاط معايير ملاحظات وتعليقات على معايير التقييم 0 الماوس العادي 1 أقل حيوية أو رغوة يتم تقييم هذا استجابة للتعامل الطبيعي ، وعادة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments C57BL / 6 ، ذكر ، 6-8 أسابيع الموارد الحيوية الأسترالية سينري ، واشنطن ، أستراليا سم السعال الديكي قائمة المختبرات البيولوجية ، وشركة كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية #181 0.1 متر فوسفات متساوي التوتر الفوسفاتي المملح (MT-PBS) سيكون للمختبرات بروتوكولها الخاص. إيزوفلوران Pharmachem ، كوينزلاند ، أستراليا سيكون للمختبرات بروتوكول خاص بها للإدارة. P0180–199 الببتيد شركة Wuxi Nordisk Biotech Co. الملازم SHG ، CHN P0180-199 ، تسلسل S - S - K - R - G - R - Q - T - P - V - L - Y - A - M - L - D - H - S - R - S الحرارة قتلت المتفطرة السلية (سلالة H37RA) ديفكو ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية #231141 مساعد فرويند الكامل (FCA) ديفكو ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية #263910 16٪ بارافورمالدهيد (PFA) خدمات المجهر الإلكتروني #15710 يخفف إلى 4٪ من PFA يوم من جمع الأنسجة. 25٪ جلوتارالدايد ProSciTech Pty Ltd ، كوينزلاند ، أستراليا # 11-30-8 يخفف إلى 2.5٪ جلوتارالديهايد يوم التثبيت. أزيد الصوديوم كيم توريد بي تي واي المحدودة ، SA ، أستراليا SL189 قم بإنشاء مخزون 10٪ (وزن / حجم) ب 0.1 مليون طن متري - PBS. استخدم بنسبة 0.03٪ (حجم / حجم). سكروز كيم توريد بي تي واي المحدودة ، SA ، أستراليا ص030 استخدم بنسبة 30٪ (وزن / حجم). درجة حرارة القطع المثلى (OCT) متوسطة ساكورا فينيتيك ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية #4583 مصل الحمار العادي ميرك ميليبور ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية #S30-100 يستخدم كمخفف للأجسام المضادة بنسبة 10٪ (حجم / حجم) أو تركيز آخر يحدده المختبر الخاص. تريتون-اكس 100 سيجما ألدريتش ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية #90o2-31-1 يستخدم في مخفف الأجسام المضادة بنسبة 0.3٪ (حجم / حجم) أو تركيز آخر يحدده المختبر الخاص. بروتين سلائف الأرانب المضاد للأميلويد (APP) Invitrogen (Life Technologies) ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية S12700 تستخدم في الساعة 1:400 أو المعايرة في المختبر الخاص. البروتين المرتبط بالأرانب المضاد للتلامس -1 (كاسبر) هدية من البروفيسور إليور بيليس، معهد فايزمان للعلوم، إسرائيل تستخدم في الساعة 1:500 أو معايرة في المختبر الخاص. الأجسام المضادة الثانوية المترافقة المناسبة من Alexa Fluor المجسات الجزيئية (تقنيات الحياة) ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية مختلف استخدميه في الساعة 1:200 أو معايرة بالتحليل الحجمي في المختبر الخاص. يخضع اختيار الأنواع التي نشأ فيها الجسم المضاد واختيار Alexa Fluor لتقدير كل مختبر. محلول تركيب مائي داكو (أجيلينت) ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية #S3023 سيكون لكل مختبر تفضيلاته الخاصة. معدات حقنة 0.5 مل مع إبر 301/2 جم دينار بحريني #326105 23 جرام إبر دينار بحريني #305143 وسادة حبر حمراء يمكن استخدام أي وسادة حبر حمراء أو صبغة طعام حمراء لتمييز أقدام. جهاز DigiGate (بما في ذلك جهاز المشي) شركة eMouse Specifics Inc. فرامنغهام ، ماساتشوستس نظام التصوير DigiGate شركة eMouse Specifics Inc. فرامنغهام ، ماساتشوستس ساعة توقيت يمكن استخدام أي مؤقت. برنامج DigiGait 8 شركة eMouse Specifics Inc. فرامنغهام ، ماساتشوستس تشريح المجهر زييس يمكن استخدام أي مجهر تشريح مناسب. الشرائح المشحونة سوبر فروست بلس ، لومب ساينتفيك بي تي واي المحدودة SF41296SP سيروستات لايكا يمكن استخدام أي سيروستات مناسب. معدات التروية وأدوات التشريح سيكون للمختبرات بروتوكتولات التروية الخاصة بها. غرفة رطبة غير شفافة قد تنتج المختبرات الخاصة بها باستخدام حاوية بلاستيكية غير شفافة. عنق الرحم GeneTex (الولايات المتحدة الأمريكية) يمكن أيضا استخدام قلم الشمع أو التوتر السطحي لإنشاء بئر حول قسم الأنسجة. مجهر متحد البؤر زيس LSM780 يمكن استخدام أي مجهر متحد البؤر مع خطوط ليزر مناسبة. فيجي / صورة J المعاهد الوطنية للصحة متاح من www.fiji.sc

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Experimental Autoimmune NeuritisMotor Function AssessmentPertussis Toxin InjectionMyelin Mimicking PeptidesTreadmill TestBlood Nerve BarrierSubcutaneous InjectionGait Function ImagingC57BL 6 MiceDemyelination Assessment

Related Articles