تصوير وقياس مجاميع البروتين في أدمغة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا

Abstract

المصدر: Donnelly، K.M.، et al. مراقبة انتقال مجاميع البروتين الشبيهة بالبريون من خلية إلى أخرى في ذبابة الفاكهة السوداء. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تصوير وقياس مجاميع البروتين في أدمغة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا. يتم إصلاح الأدمغة وغسلها ومعالجتها بعامل مضاد للبهتان قبل تركيبها. يتم التقاط الصور باستخدام مجهر متحد البؤر وتحديدها كميا لمراقبة انتقال مجاميع البروتين الطافرة.

Protocol

فئة

1. اقتران Gal4- و QF التعبير الجيني المعدل Htt بوساطة ذبابة الفاكهة

1. جمع و / أو إنشاء خطوط ذبابة الفاكهة السوداء المعدلة وراثيا التي تحتوي على "سائقات" Gal4 أو QF الخاصة بالأنسجة ، بالإضافة إلى الخطوط التي تحتوي على جينات Htt من النوع البري أو المتحولة في اتجاه مجرى Gal4-UAS أو QF-QUAS. تأكد من دمج البروتينات التي يتم التعبير عنها من هذه الجينات المعدلة وراثيا مع بروتينات الفلورسنت أو علامات حاتمة للسماح بالتمايز بين منتجات الجينات المعدلة وراثيا من النوع البري Htt في نفس الذبابة. انظر الشكل 1.
   ملاحظة: عادة ما نستخدم شظايا exon 1 من جين Htt البشري. ومع ذلك ، يمكن بدلا من ذلك توليد الذباب المعدل وراثيا للتعبير عن شظايا Htt الأطول أو الجينات الأخرى إذا رغبت في ذلك.
2. خطط للاستراتيجية الجينية بحيث يتم التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا من النوع الطافرة والبرية في مجموعات خلايا مميزة وغير متداخلة.
   1. في حالة حدوث أي تداخل في التعبير ، فإن بروتينات Htt الطافرة والبرية التي يتم تصنيعها في نفس الخلايا ستتجمع وتمنع اكتشاف الأحداث الشبيهة بالبريون. لتجنب ذلك ، استخدم مثبطات Gal4 و QF الخاصة ، Gal80 و QS40 ، على التوالي (الشكل 1). يمكن أن يساعد اختيار محركات Gal4 و / أو QF التي يتم التحكم فيها عن النمو في تقييد التعبير عن Htt الطافرة إلى خلايا ما بعد الانقسام ، مما يلغي احتمال أن يساهم انقسام الخلية في انتشار الركام من خلية إلى خلية.
3. باستخدام شروط الاستزراع القياسية ، قم بتزاوج الذباب لتوليد ذرية تعبر عن Htt الطافرة عبر QF (أو Gal4) في مجموعة الخلايا "المانحة" و Htt من النوع البري عبر Gal4 (أو QF) في مجموعة الخلايا "المتلقية". انظر الشكل 1 للحصول على مخطط يوضح تركيبة جينية محتملة.
   ملاحظه: تشمل برامج تشغيل QF و Gal4 التي تم استخدامها لإنشاء البيانات الموضحة في الأشكال 1-4 وفي منشورنا السابق سائق الخلايا العصبية للمستقبلات الشمية DA1 (ORN) ، Or67d-QF ، وسائق عموم الدبقية ، repo-Gal4.
4. قم بتوليد ذباب التحكم بالتوازي الذي يعبر عن Htt من النوع البري في كل من مجموعات الخلايا المسماة QF و Gal4.
5. اجمع ذرية النمط الجيني المطلوب وعمر حسب الاقتضاء.

< p class = "jove_title" >2. التشريح الدقيق وتثبيت أدمغة ذبابة الفاكهة البالغة

ملاحظة: تم تعديل إجراء التشريح هذا من منشور سابق ويمكن استخدامه لإعداد الأدمغة لتصوير إشارات التألق المباشرة من اندماج البروتين الفلوري Htt.

1. اجمع المواد التالية وضعها على الثلج: محلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.03٪ Triton X-100 (PBS / T) ؛ أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 970 ميكرولتر من محلول مثبت 4٪ paraformaldehyde (PFA) المحضر بإضافة 200 ميكرولتر 20٪ PFA إلى 770 ميكرولتر PBS / T ؛ طبق زجاجي شفاف يحتوي على بئر ؛ ماصة نقل يمكن التخلص منها ؛ ملقطان تشريحيان (أحدهما رقم 3 والآخر رقم 5).
2. قم بتخدير الذباب البالغ باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ ونقله إلى بئر واحد من الطبق الزجاجي على الجليد.
3. باستخدام ماصة النقل ، أضف كمية صغيرة (~ 500 ميكرولتر) من PBS / T البارد إلى البئر الذي يحتوي على الذباب وإلى بئر فارغ. تجنب إدخال الكثير من الفقاعات ، لأنها يمكن أن تتداخل مع التشريح.
4. ضع الطبق الزجاجي على سطح مستو أسفل مجهر تشريح واضبط التكبير حتى يملأ جسم الذبابة مجال الرؤية ويكون في بؤرة التركيز.
5. ضع زوجا من مصادر الضوء ذات الرأس المنحنية بحيث يضيء الضوء جانبي الطبق الزجاجي. قم بتثبيت أنسجة المختبر المطوية أسفل الطبق الزجاجي للتخلص من أجزاء الجسم / البشرة أثناء التشريح.
6. باستخدام الملقط رقم 3 في اليد غير المهيمنة ، انقل ذبابة واحدة إلى البئر الذي يحتوي على PBS / T. قم بتثبيت الذبابة عن طريق الإمساك ببطنها بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى.
7. مع إبقاء الذبابة مغمورة بالكامل في PBS / T ، قم بإزالة رأس الذبابة باستخدام الملقط رقم 5 في اليد المهيمنة. أدخل طرفا واحدا من هذه الملقط أسفل البشرة في المساحة الصغيرة المجاورة للخرطوم على جانب واحد من رأس الذبابة. قم بتأمين قبضة الرأس عن طريق الضغط على الملقط للإمساك بالعين من كلا الجانبين.
8. قم بإزالة رأس الذبابة من جسمها عن طريق سحب الملقطين عن بعضهما البعض. تخلص من جسم الذبابة على أنسجة مختبر موضوعة في مكان قريب. حافظ على الضغط على ملقط اليد المهيمنة حتى لا يضيع رأس الذبابة.
9. ضع طرف واحد من الملقط رقم 3 في اليد غير المهيمنة في نفس المساحة الصغيرة أسفل البشرة على الجانب الآخر من خرطوم. بمجرد وضعه ، اضغط على الملقط لإمساك العينين في نفس المكان على جانبي الرأس.
10. بمجرد أن تصبح قبضة البشرة آمنة ، اسحب الملقط برفق عند 180 درجة. سيؤدي هذا الإجراء إلى تفكيك بشرة الرأس دون الإضرار بالدماغ. تخلص من بقايا البشرة على مناديل المختبر.
    1. على الرغم من أنها مثالية ، إلا أنه لا يمكن إزالة بشرة الرأس بالكامل في خطوة واحدة. في هذه الحالة ، قم بإزالة البشرة قطعة قطعة حتى يتعرض الدماغ بالكامل. احرص على عدم إتلاف الدماغ عن طريق تجنب الاتصال المباشر بالملقط.
11. قم بإزالة الدماغ المقطوع من PBS / T إما عن طريق الإمساك بقصبة هوائية متصلة أو عن طريق شفط الدماغ في الفراغ بين أطراف الملقط عن طريق العمل الشعري.
    ملاحظه: تعد إزالة القصبة الهوائية اختيارية ، لأنها لا تميل إلى حجب فصوص الهوائيات على السطح الأمامي للدماغ حيث نصور عادة. ومع ذلك ، إذا تداخلت القصبة الهوائية مع التصوير ، فقم بإزالتها بعناية حتى لا يتضرر الدماغ من هذا التلاعب.
12. انقل دماغ الذبابة إلى أحد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على محلول مثبت على الجليد. تأكد من انفصال الدماغ عن الملقط وغمره في محلول التثبيت.
بمجرد تشريح
13. جميع الأدمغة ، قم بإخضاعها ل "إصلاح قصير" عن طريق وضع الأنابيب المغلقة على المغذي لمدة ~ 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    ملاحظة: تضمن خطوة التثبيت القصيرة هذه أن الأدمغة أسهل في التعامل معها في الخطوات اللاحقة ولا تلتصق بجوانب أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
14. قم بإزالة غالبية محلول التثبيت باستخدام ماصة P1000 وتخلص منه.
    1. تجنب شفط الدماغ من الأنبوب خلال هذه الخطوة وأي خطوة غسيل لاحقة. اضبط P1000 على حجم أقل (على سبيل المثال ، 650 ميكرولتر) وقم بإزالة المادة الطافية في خطوتين. بالإضافة إلى ذلك ، أمسك أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بما يتماشى مع مصدر الضوء (مثل الأضواء العلوية) أثناء الطموح لتصور الأدمغة بشكل أفضل.
15. أضف 1 مل من PBS / T الطازج إلى الدماغ. يغسل بسرعة (< 1 دقيقة) في الظلام ، ويشفط المادة الطافية من الدماغ ، وتخلص منها.
16. كرر الغسيل باستخدام PBS / T في الظلام في درجة حرارة الغرفة وفقا للجدول الزمني التالي: غسلتان سريعتان (< 1 دقيقة) ، 1 × 5 دقائق ، 3 × 20 دقيقة ، و 1 × 1 ساعة غسل. قم بتثبيت القمم على أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وضع الأنابيب على مغذيات بين الغسل.
    1. إذا كنت ترغب في تلطيخ DAPI ، فاستبدل الغسيل الأخير لمدة ساعة واحدة بحضانة 1 × 30 دقيقة ب 250 نانوغرام / مل DAPI مخفف في PBS / T ، متبوعا بغسلتين سريعتين و 1 × 20 دقيقة.
17. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة غالبية المادة الطافية للغسيل ، مع الحرص على عدم إزعاج الأدمغة ، وأضف 30 ميكرولتر من الكاشف المضاد للبهتان القائم على الجلسرين إلى الدماغ. احتضن عند 4 درجات مئوية في الظلام دون حركة لمدة ساعة واحدة على الأقل وحتى 24 ساعة.

< ص الفئة = "jove_title" >3. تصاعد الدماغ كله

1. ضع شريحة مجهر زجاجي تحت مجهر تشريح وقم بتسميتها بمعلومات التعريف.
   ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن تركيب الأدمغة مباشرة على غطاء زجاجي للوصول إلى جانبي الدماغ أثناء التصوير. تم نشر بروتوكول يصف إجراء التركيب هذا سابقا45.
2. قم بإزالة الأدمغة من كل أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام طرف ماصة ضعيف (يتم تحضيره باستخدام شفرة حلاقة لإزالة الجزء السفلي ~ 1 سم من طرف 1-200 ميكرولتر) ونقلها إلى منتصف الشريحة. انقل أقل قدر ممكن من الكاشف المضاد للبهتان مع الدماغ.
3. استخدم الملقط لوضع الأدمغة في الاتجاه المطلوب (على سبيل المثال ، يشير الظهر نحو الجزء العلوي من الشريحة والسطح الأمامي المواجه لأعلى لتصوير فص الهوائي). عند توجيه الأدمغة ، ضع في اعتبارك مسار ضوء المجهر لاستخدامه لتصويرها.
4. قم بإزالة الكاشف الزائد المضاد للبهتان من الشريحة باستخدام الزاوية المدببة لأنسجة المختبر المطوية دون إزعاج الدماغ. دع الشريحة تجلس لمدة ~ 5-10 دقائق في الظلام للسماح للأدمغة بالالتصاق بالشريحة.
5. أحيط أدمغة الذبابة بأربع قطع صغيرة من زجاج الغطاء المكسور الموضوعة على كل جانب من جوانب الأدمغة لتشكيل مربع ~ 19 مم × 19 مم. ضع حافة واحدة من زجاج الغطاء رقم 1.5 مقاس 22 مم × 22 مم خارج إحدى هذه القطع الصغيرة من الزجاج مباشرة ، وقم بخفض الغطاء برفق فوق الدماغ لإكمال تثبيت الجسر.
6. قم بتوزيع الكاشف المضاد للبهتان الطازج ببطء لملء السطح الموجود أسفل الغطاء ، مع الحرص على عدم إزعاج الغطاء أو الدماغ. امسح أي مادة مضادة للبهتان الزائدة باستخدام الزاوية المدببة لأنسجة المختبر المطوية دون ملامسة الغطاء مباشرة.
7. أضيفي قطرة من طلاء الأظافر الشفاف سريع الجفاف إلى كل زاوية من الزوايا الأربع للغطاء. اتركيه ليجف لمدة ~ 10 دقائق. بعد ذلك ، أغلق الحواف الأربعة للغطاء بطلاء الأظافر لإحاطة الأدمغة بالكامل.
8. صورة الدماغ على الفور أو تخزينها في 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة.
   1. في حالة تصوير التألق الجوهري من اندماج البروتين الفلوري Htt ، قم بتصوير الأدمغة في غضون 24 ساعة للحصول على أفضل إشارة.

< p class = "jove_title" >4. تصوير وقياس نقل الركام الشبيه بالبريون

1. قم بتصوير الأدمغة المركبة باستخدام مجهر متحد البؤر مزود بهدف زيت 40X أو 60/63X لجمع صور شريحة z عبر منطقة الدماغ حيث يتم التعبير عن محركات Gal4 و QF المحددة (الشكل 2 أ ، ب).
   1. قم بإثارة اندماجات البروتين الفلوري أو البروتينات ذات العلامات المناعية باستخدام الليزر المناسب (على سبيل المثال ، 488 نانومتر ل GFP / YFP / FITC أو 552 نانومتر ل mCherry / Cy3). قم بتعيين نوافذ الكشف التي تلتقط أقصى إشارة فلورية مع التخلص من الحديث المتبادل للقناة باستخدام نظام الكشف الطيفي أو مرشحات انبعاث النطاق / التمرير الطويل الخاصة بكل فلوروفور.
      ملاحظة: كن منتبها عند تصوير مجاميع البروتين. من السهل أن تصبح وحدات البكسل الموجودة في وسط كل ركام مشبعة ، خاصة في الركام الأكبر. حاول تقليل التشبع في الصورة ، ولكن كن على دراية بخطر فقدان الإشارة من الأنواع المجمعة الأصغر (الشكل 2 ب ، ج ، د). سيؤدي التشبع المفرط إلى زيادة خلفية الصورة ، مما يجعل من الصعب تحديد النقاط المعزولة. اختبر إعدادات التصوير المختلفة للتحسين قبل التقاط الصور النهائية في كل مجموعة بيانات.
2. قم بتحليل البيانات عن طريق تحديد النقاط النقطية الفردية إما يدويا عن طريق التنقل عبر شرائح z الفردية (على سبيل المثال ، الشكل 2 ج والشكل 4 أ) أو بعد عرض الشرائح متحد البؤر في 3 أبعاد (الشكل 3 أ ، ب).
   ملاحظه: يمكن القيام بذلك في الصورة J أو برامج معالجة الصور الأخرى.
   1. إذا كانت المجاميع مفصولة جيدا وكان هناك حد أدنى من مضان الخلفية ، فاستخدم برنامج تحليل الصور لتحديد المجاميع وتحديدها كميا وتحليلها بشكل منهجي على أنها "كائنات" أو "أسطح" مميزة في إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للمكدس متحد البؤر (الشكل 3 ب).
      ملاحظه: إجراءات البرامج الموضحة خاصة بالأداة والبرامج المستخدمة هنا (انظر جدول المواد).
      1. تصور سلسلة z متحدة البؤر في وضع العرض ثلاثي الأبعاد. استخدم معالج "التحليل" لتحديد النقاط الفردية في قناة محددة (على سبيل المثال ، القناة الحمراء لمجاميع HttQ91-mCherry في الشكل 3). اضبط العتبة والمرشحات لتمثيل جميع التجميعات غير المتجانسة الحجم ككائنات فردية في الصورة بدقة.
      2. قم بتمكين "تقسيم الكائنات" ضمن "التصفية المسبقة للمعالجة الثنائية" لفصل التجميعات المرتبطة ارتباطا وثيقا والتي تم دمجها بشكل شاذ بواسطة خوارزمية البرنامج. لاحظ أنه يتم الإبلاغ عن العدد الإجمالي للكائنات والقياسات المرتبطة بها ضمن "القياسات"
         ملاحظه: هذه الطريقة لقياس مجاميع Htt الطافرة غير قابلة لبروتوكول التلوين المناعي لأن مركز مجاميع الأميلويد غير قابل للاختراق للأجسام المضادة. نتيجة لذلك ، تظهر الركام على المجهر كهياكل تشبه الحلقة وبرنامج تحليل الصور غير قادر على تحديد وتمييز هذه "البقع" الفردية بدقة.
   2. قم بتحديد مجاميع Htt من النوع البري عن طريق التحرك يدويا عبر z-stack وتسجيل مجاميع Htt من النوع البري ، مما يضمن عدم تسجيل أي مجاميع مضاعفة إذا ظهرت في أكثر من شريحة واحدة (الشكل 4 أ).
      ملاحظه: يمكن استخدام نهج القياس الكمي اليدوي هذا عندما يكون عدد المجاميع في كل مكدس متحد البؤر معقولا (على سبيل المثال ، 20-50). من المفيد أيضا عندما يتعذر على برنامج تحليل الصور التمييز بين النقاط الفردية والإشارة المحيطة في نفس القناة (على سبيل المثال ، الإشارة من Htt من النوع البري المنتشر في الخلايا القريبة) (الشكل 2 ب ، ج والشكل 4 أ). يمكن أن يكون القياس الكمي لمجاميع Htt من النوع البري أمرا صعبا أيضا لأن العديد من الهياكل الطبيعية في الدماغ تبدو ثقبة (على سبيل المثال ، عمليات الخلايا والمشابك العصبية). يمكن استخدام التوطين المشترك لإشارات Htt من النوع البري والمتحور كمعيار للاختيار. ومع ذلك ، فمن الممكن أن تقع بعض "بذور" Htt الطافرة إلى ما دون حد الكشف عن الكونفوكال. يمكن استخدام بروتين آخر غير Htt لا يتجمع في الخلايا المتلقية (على سبيل المثال ، GFP) لتسمية الهياكل المنقطة غير ذات الصلة في الدماغ.
3. استخدم برنامج تحليل الصور لإجراء مزيد من التوصيف للمجاميع الفردية. على سبيل المثال ، حدد توزيع حجم الركام (الشكل 3 ج) ، أو النسبة المئوية للتوطين المشترك بين بروتينات Htt الطافرة والبرية (الشكل 4 أ) ، أو قم بقياس تفاعلات البروتين والبروتين مباشرة باستخدام FRET (الشكل 4 ب).
   1. حدد توزيع حجم النقاط النقطية الفردية باستخدام خوارزمية الكشف عن النقاط أو السطح التي تحدد بدقة جميع المجاميع المرئية في قناة معينة. استخدم برنامج تحليل الصور لأخذ القياسات ذات الصلة للبقع أو الأسطح ، على سبيل المثال الحصول على معلومات "القطر الإجمالي" (الشكل 3C) أو "الحجم" أو "الكثافة" من "القياسات" في معالج "التحليل" الموضح في الخطوة 4.2.1.
      ملاحظه: في الشكل 3C ، نبلغ عن توزيع الأقطار لجميع HttQ91-mCherry puncta المحددة في كبيبة DA1 واحدة.
   2. تحديد النسبة المئوية للتوطين المشترك بين مجاميع HttQ25-YFP و HttQ91-mCherry عن طريق تحريك شريحة تلو الأخرى يدويا من خلال مكدس z متحد البؤر (الطريقة الأكثر دقة). ومع ذلك ، احرص على عدم حساب أي مجاميع مرتين. لمنع ذلك ، قم بحساب التجميعات في شريحة z معينة فقط إذا كان مستوى التركيز عبر مركز التجميع (الشكل 4 أ).
   3. احسب كفاءة FRET لمجاميع HttQ25-YFP المستحثة باستخدام إشارة HttQ91-mCherry المتوضعة باستخدام طريقة التبييض الضوئي المستقبل.
      1. أولا ، تخلص من الحديث المتبادل المحتمل بين قنوات YFP و mCherry من خلال إنشاء نوافذ كشف لإشارات mCherry فقط و YFP فقط التي لا تنتج أي إشارة في القناة الأخرى. باستخدام هذه الإعدادات ، التقط "صورة مسبقة" لنقطة HttQ25-YFP الفردية وإشارة HttQ91-mCherry المرتبطة بها (الشكل 4 ب).
      2. بعد ذلك ، قم بتبييض إشارة mCherry عن طريق ضبط الليزر الأحمر (على سبيل المثال ، 552 نانومتر) إلى شدة 100٪ وقم بالمسح الضوئي حتى تختفي الإشارة. ارجع إلى الإعدادات المستخدمة ل "الصورة السابقة" ، والتقط "صورة لاحقة" لنفس النقطة (الشكل 4 ب).
      3. احسب قياسات شدة التألق لكل نقطة قبل وبعد التبييض الضوئي باستخدام برنامج تحليل الصور.
      4. احسب كفاءة FRET عن طريق طرح مضان المتبرع YFP المقاس في "الصورة السابقة" (YFPinitial) من تألق المتبرع YFP في "الصورة اللاحقة" (YFPfinal). اقسم هذه القيمة على YFPfinal، واضرب في 100.
         ملاحظه: يمكن حساب كفاءة FRET بكسل تلو الآخر أو بشكل عام لكل مجموع HttQ25-YFP (الشكل 4 ب). يعد التبييض الضوئي المتقبل تقنية مفيدة بشكل خاص لحساب كفاءة FRET عندما تكون إشارة mCherry المرتبطة بكل نقطة HttQ25-YFP عالية بما يكفي لإنتاج فك YFP يمكن اكتشافه بعد التبييض الضوئي mChery.

Results

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. نهج جيني للتعبير المقترن بالجينات المعدلة وراثيا Htt من النوع البري الطافرة باستخدام أنظمة التعبير الثنائية QF-QUAS و Gal4-UAS. في "الخلية أ" ، يتم التعبير عن بروتين Htt المتحور الذي يحمل علامة mCherry والذي يحتوي على امتداد polyQ بطول ممرض (Q91) باستخدام محرك QF الموجود في اتجاه مجرى المحفز الخاص بالأنسجة A ("PA"). في "الخلية ب" ، يتم التعبير عن Htt من النوع البري الموسوم ب YFP و...

Materials