تقييم الاستعمار البكتيري في دماغ الفأر بعد عدوى الليستيريا المستعدة

الملخص

المصدر: Ghosh ، P. ، et al. ، عدوى الليستيريا monocytogenes في الدماغ. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو القياس الكمي للحمل البكتيري المعدي من دماغ الفأر المتدفق المصاب بالليستريا monocytogenes.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< ص الفئة = "jove_title">1. حصاد الأعضاء وتحديد الأعباء البكتيرية

1. بعد التروية ، حصاد الأعضاء (مثل الكبد والطحال) عن طريق إزالة أي أوعائية وأربطة متصلة بعناية ووضع الأعضاء بشكل منفصل في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من البرودة المعقمة (4 درجات مئوية) PBS. قم بتخزين العينات على الثلج حتى تحدث المزيد من المعالجة.
2. لحصاد الدماغ ، اقطع رأس الرأس خلف الأذنين باستخدام المقص واقطع جلد فروة الرأس بين عيني أسفل خط الوسط. إذا لزم الأمر ، قم بقص الأنسجة الزائدة ، مع إبقاء المقص مضغوطا على الجمجمة.
   1. أدخل طرفا واحدا من المقص برفق في الثقبة ماغنوم (الثقب الموجود في قاعدة الجمجمة الذي يمر من خلاله الحبل الشوكي) واقطع بشكل جانبي في الجمجمة على كلا الجانبين.
   2. اقطع الجمجمة برفق بين عيني القوارض أسفل خط الوسط ، مع الضغط الجانبي. تجنب إزعاج الدماغ وحافظ على الحد الأدنى من الاتصال بين أنسجة المخ والمقص.
   3. باستخدام ملقط رفيع الأطراف، افتح الجمجمة لكشف الدماغ وضع ملعقة بين الجانب السفلي من الدماغ وقاعدة الجمجمة لإزالة الدماغ.
      ملاحظه: ينتج عن هذا تمزق الألياف العصبية في الدماغ.
   4. انقل الدماغ بعناية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من PBS البارد المعقم.
   5. تخلص من جثة الفأر ، وكرر هذه الخطوات للحيوانات المتبقية.
      ملاحظه: بمجرد حصاد جميع الأعضاء ، قم بتنظيف منطقة الإجراء واستعد لتجانس الأعضاء لتحديد الأعباء البكتيرية.
3. قم بتنظيف وتعقيم طرف الخالط الأنسجة الموجود في خزانة السلامة الحيوية عن طريق إدخال الطرف وتشغيل الخالط لمدة 10 ثوان بالتتابع في 5٪ مبيض ، وماء معقم ، و 75٪ إيثانول ، وماء معقم ، كل منها موجود في أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل.
4. تجانس الدماغ المصاب (~ 20 ثانية عند الإعداد 6 ، الحد الأقصى لدورة في الدقيقة) في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل حتى لا تبقى شظايا الأنسجة المرئية.
   1. قم بتنظيف الخالط كما هو موضح في الخطوة 1.3 لمنع التلوث البكتيري المنقول إلى عينة العضو التالية.
   2. إجراء عملية التجانس لجميع الأعضاء الأخرى (مثل الكبد والطحال).
   3. بمجرد اكتمال عملية التجانس ، قم بتنظيف الخالط كما هو موضح في الخطوة 1.3 وقم بتخزينه حتى الاستخدام الآخر.
5. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف للعضو المتجانس في PBS المعقم وقم بلوحة التخفيفات على ألواح BHI agar / streptomycin لتحديد CFU لكل عضو.
   ملاحظة: يتم تنفيذ طريقة مماثلة لتحديد CFU لكل مل من الدم.
   1. بعد طلاء جميع التخفيفات ، انقل الألواح إلى حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل.
   2. في اليوم التالي ، احسب عدد المستعمرات في كل لوحة لتحديد العدد الإجمالي للبكتيريا لكل عضو أو مل من الدم على النحو التالي:
      CFU / عضو = (عدد المستعمرات × عامل التخفيف) / مل من مطلي بالمتجانس × 5
      CFU / مل من الدم = (عدد المستعمرات × عامل التخفيف) / مل من الدم المطلي

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات وسائط ضخ القلب في الدماغ بيكتون ديكنسون هاتف: 237200 كبريتات الستربتومايسين أمريسكو 0382-50 جرام أطباق بتري VWR هاتف: 25384-342 الجلسرين VWR 97062-832 IKA T18 الخالط الأساسي ULTRA-TURRAX إيكا 3352109 الموديل: T18BS1 مقياس الطيف الضوئي بيكمان كولتر سلسلة DU 800 الفئران BALB / c مختبر جاكسون نموذج #000651 حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك سيجما ألدريتش 60004 15 مل أنابيب مخروطية الشكل VWR 21008-918 محلول ملحي مخزن بالفوسفات كورنينج 46-013 سم ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ VWR 82027-520 مقص من الستانلس ستيل (4.5 بوصة) VWR 82027-578 ملقط ذو طرف ناعم من الفولاذ المقاوم للصدأ (6 بوصات) VWR 82027-406