مقالة منهجية

الكشف عن التوطين المشترك لمستقبلات الأوريكسين والقنب في أسماك الزرد البدينة التي يسببها النظام الغذائي

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Imperatore، R.، et al. تحديد مستقبلات Orexin و endocannabinoid في أسماك الزرد البالغة باستخدام طرق الإيمونوبيروكسيداز والتألق المناعي. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا للتحقيق في التوطين المشترك لمستقبلات الأوريكسين والقنب في أنسجة دماغ السمنة الزرد البالغة الطبيعية والناجمة عن النظام الغذائي (DIO) باستخدام التألق المناعي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

فئة

1. بروتوكول التألق المناعي

  1. تشريح الأنسجة
    1. قم بالتضحية بسمك الزرد عن طريق الغمر في الماء المثلج (5 أجزاء من الثلج / 1 جزء من الماء ، 4 درجات مئوية) ؛ اتركها حتى توقف كل حركة لضمان الموت بسبب نقص الأكسجة.
    2. قم بإزالة الرأس بشفرة حلاقة. قم بإزالة الأنسجة الرخوة من الجانب البطني للجمجمة باستخدام ملقط. افتح الجمجمة وأزل العظم من الجانب البطني من الدماغ. إزالة الجلد وعظام الجمجمة من الجانب الظهري من الدماغ. إزالة الدماغ.
  2. تثبيت الأنسجة
    1. قم بإصلاح الدماغ عن طريق الغمر لمدة 3 ساعات في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) عند 4 درجات مئوية.
      1. قم بإعداد 0.1 M من محلول الفوسفات (PB) عن طريق إذابة 1.755 جم من NaH2POو 4H2O و 4.575 جم من Na2HPO4 في 450 مل من الماء المقطر (dH2O) واضبطه على درجة حموضة 7.4 مع الكمية اللازمة من NaOH 1N.
      2. تحضير 4٪ PFA لإذابة 4 جم من PFA في 100 مل من 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) عن طريق التحريك على لوح حراري. عند الوصول إلى درجة حرارة 60 درجة مئوية ، أضف 2-4 قطرات من هيدروكسيد الصوديوم 1N للحصول على محلول واضح. ترك PFA 4٪ في درجة حرارة الغرفة (RT) والتحكم في الرقم الهيدروجيني. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
        ملاحظه: يعتمد وقت التثبيت على حجم الأنسجة. قد يؤدي تثبيت الأنسجة لأكثر من 4-6 ساعات إلى فرط التثبيت ، مما يخفي المستضدات ويحد من ارتباط الأجسام المضادة والحاتمة.
  3. تضمين الأنسجة
    1. اشطف المناديل 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ، مع 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4).
    2. للحماية من التبريد، انقل الأنسجة إلى 20٪ سكروز في PB (0.1 M، درجة الحموضة 7.4) واحتفظ بها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى 30٪ سكروز في 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) واحتفظ بها لليلة إضافية عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بتضمين الأنسجة في كتلة من مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT). للقيام بذلك ، قم بإعداد ديوار صغير من النيتروجين السائل ، وخذ رقائق الألومنيوم ، واقطعه إلى نصفين لإنشاء مقلاة. يجب غمس المقلاة التي تحتوي على الأنسجة المملوءة بمركب OCT في النيتروجين السائل حتى يتم تبريد مركب OCT. يمكن تخزين الأنسجة المجمدة عند -80 درجة مئوية حتى التقسيم.
  4. قطع الأنسجة
    1. انقل كتل الأنسجة المجمدة إلى ناظم البرد عند -20 درجة مئوية وقم بتقطيعها إلى أقسام إكليلية أو سهمية بحجم 10 ميكرومتر.
    2. اجمع الأنسجة في أقسام تسلسلية بديلة على شرائح زجاجية لاصقة مناسبة للكيمياء المناعية وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظه: قم بتخزين الشرائح بين -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية في صندوق شرائح داكن أو دفتر شرائح.
  5. حجب مواقع الربط غير المحددة ونفاذية الأنسجة
      حدد
    1. منطقة الأنسجة على الشريحة بقلم مقاوم للمذيبات.
    2. اشطف الأقسام 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ، مع 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4).
    3. احتضان الأقسام بمصل الحمار العادي بنسبة 1٪ المذاب في المخزن المؤقت للنفاذية PB-Triton X-100 0.3٪ (PB-T) لمدة 30 دقيقة في RT لاختراق غشاء الخلية وسد مواقع الارتباط غير المحددة.
      1. تحضير Triton X-100 0.3٪ إذابة 0.3 مل من Triton X-100 في 100 مل من 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4).
      2. تحضير محلول المانع لإذابة مصل الحمار العادي 1٪ في PB يحتوي على 0.3٪ TritonX-100.
        ملاحظه: تعتمد الأنواع الحيوانية من المصل المستخدمة في النفاذية والحجب على مضيف الجسم المضاد الثانوي.
  6. حضانة مع مزيج من الأجسام المضادة الأولية
    1. اشطف الأقسام 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ، مع 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4).
      1. احتضان الأقسام طوال الليل في صندوق رطب في RT بمزيج من الأجسام المضادة الأولية المخففة في PB-T. يمكن استخدام المزيج التالي من الأجسام المضادة الأولية: الجسم المضاد للماعز ضد مستقبلات أوركسين (OX-2R) المخفف 1: 100 / الجسم المضاد للأرانب ضد مستقبلات القنب (CB1R) المخفف 1: 100 ، أو الجسم المضاد للماعز ضد ببتيد الأوريكسين (OX-A) المخفف 1: 100 / الجسم المضاد للأرانب ضد CB1R المخفف 1: 100.
  7. حضانة بمزيج من الأجسام المضادة الثانوية
    1. اشطف الأقسام 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ، مع 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4).
    2. احتضان الأقسام لمدة ساعتين في RT مع 1) مزيج من الحمير المضادة للأرانب Alexa Fluor 488 الأجسام المضادة الثانوية المترافقة والحمار المضاد للماعز Alexa Fluor 594 الأجسام المضادة الثانوية المخففة 1: 100 في PB-T ؛ أو 2) مزيج من الحمير المضادة للماعز Alexa Fluor 488 الأجسام المضادة الثانوية المترافقة والحمار المضاد للأرانب Alexa Fluor 594 المضاد الثانوي المخفف 1: 100 في PB-T.
      ملاحظه: استخدم الأجسام المضادة الثانوية التي تم تطويرها في نفس مضيف. يجب أن ينتمي المصل الطبيعي إلى نفس النوع من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال ، استخدم الأجسام المضادة الثانوية التي تم تطويرها في الحمار ومصل الحمار العادي). قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية والثانوية باستخدام المخزن المؤقت الذي يحتوي على المنظف لزيادة نفاذية الخلايا وتقليل الخلفية.
  8. تركيب الأنسجة
    1. اشطف الأقسام 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها ، مع 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4).
    2. قم بمضاد للأقسام بصبغة نووية DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) المحضرة لإذابة 1.5 ميكرولتر من DAPI (1 مجم / مل) في 3 مل من PB.
    3. شرائح الغطاء مع وسيط التركيب (انظر جدول المواد). يعمل وسيط التثبيت المائي هذا على استقرار عينة الأنسجة والبقع للاستخدام على المدى الطويل. يمكن تخزين عينات الفلورسنت في الظلام عند 4 درجات مئوية. لإطالة عمر الفلوروفورات ، استخدم وسيط تركيب مضاد للبهتان.
      ملاحظه: اختر وسيط تركيب جيد. واحدة من أهم معلمات عوامل التركيب هي معامل الانكسار (nD) ، والذي يجب أن يكون حوالي 1.5 ، معامل انكسار الزجاج. يمكن استخدام وسيط التثبيت المستخدم هنا بشكل خاص مع العينة المعدة لتحديدات الإنزيم والدهون (أي عينة يجب عدم تجفيفها بسلسلة تصاعدية من الكحول).
  9. عناصر التحكم
    1. كرر الأقسام 1.1-1.8 ، مع حذف الجسم المضاد الأولي أو الثانوي ، أو استبدال الأمصال الأولية أو الثانوية في الخطوة المحددة ب PB (التحكم السلبي).
    2. كرر الأقسام 1.1-1.8 ، مع امتصاص كل جسم مضاد أولي مسبقا مع فائض من الببتيد النسبي (100 مجم من الببتيد / 1 مل من مصل المخفف).
    3. كرر الأقسام 1.1-1.8 على شرائح دماغ الفأر (التحكم الإيجابي).
      ملاحظه: قم بإعداد جميع المخازن المؤقتة طازجة ، قبل وقت قصير من البدء. قم بإزالة السوائل الزائدة بعناية في كل خطوة باستخدام ماصة أو ورق ترشيح حول الأقسام ، مع الحفاظ على رطوبة القسم دائما.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مكافحة CB1 أبكام أب23703 مضاد OX-2R سانتا كروز SC-8074 مضاد أوكسا سانتا كروز SC8070 كرايوستات نظام لايكا الحيوي CM3050S دابي سيجما ألدريتش 32670 الحمار المضاد للماعز الفلور أليكسا 488 الأجسام المضادة الثانوية المترافقة ثيرمو فيشر أ 11055 الحمار المضاد للماعز الأجسام المضادة الثانوية المترافقة أليكسا فلور 594 ثيرمو فيشر أ 11058 الحمار المضاد للأرانب أليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية المترافقة ثيرمو فيشر أ 21206 الحمار المضاد للأرانب الأجسام المضادة الثانوية المترافقة Alexa 594 ثيرمو فيشر أ 21207 الإيثانول المطلق VWR 2,08,21,330 مركب القسم المجمد نظام لايكا الحيوي FSC 22 وسائط القسم المجمد حمض الهيدروكلوريك VWR 2,02,52,290 ImmPACT DAB مختبر النواقلات سك 4105 مجهر نظام لايكا الحيوي DMI6000 ميكروتوم نظام لايكا الحيوي RM2125RT نا2HPO4 سيجما ألدريتش S9763 كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش إس 7653 NaH2PO4H2O سيجما ألدريتش إس 9638 هيدروكسيد الصوديوميوم سيجما ألدريتش إس 8045 مصل الحمار العادي سيجما ألدريتش د9663 مصل الأرنب العادي مختبر النواقلات إس -5000 بارافورمالديد سيجما ألدريتش ص 6148 تريتون X-100 فلوكا التحليلية 93420 تريزما سيجما ألدريتش [ت1503] مجموعة VectaStain Elite ABC مختبر النواقلات PK6100

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DAPI

مقالات ذات صلة