دراسة تغلغل FITC و FITC-Ferritin من خلال نموذج الحاجز الدموي الدماغي في المختبر

الملخص

المصدر: Fiandra، L.، et al. في المختبر في المختبر للفريتين المحمل بتقنية FITC عبر حاجز دموي دماغي للفئران: نموذج لدراسة توصيل الجزيئات النانوية. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو طريقة لدراسة النفاذية من خلال نموذج الحاجز الدموي الدماغي في المختبر (BBB) باستخدام الخلايا النجمية والخلايا البطانية على إدراج غشاء ، مع FITC مجاني وفيريتين محمل ب FITC. يرتبط FITC-ferritin بالمستقبلات الموجودة على الخلايا البطانية ويعبر حاجز الغشاء إلى الغرفة السفلية بينما أظهر FITC الحر نفاذية مقيدة وظل في الغرفة العلوية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إنشاء نموذج BBB

ملاحظة: لإنشاء نموذج الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ، نقترح استخدام الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفئران الأولية المتوفرة تجاريا (RBMECs) والخلايا النجمية القشرية للفئران (RCAs). يجب تنفيذ جميع الخطوات باستخدام كواشف معقمة ومستهلكات يتم التعامل معها في غطاء تدفق رقائقي.

1. زراعة الخلية
   1. قوارير ثقافة الخلايا المعطف ب poly-L-lysine 100 ميكروغرام / مل (1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، RT) أو الفيبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل (ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية) لتعزيز ارتباط RCAs أو RBMECs ، على التوالي. بعد ذلك ، قم بإذابة 1 × 10⁶ RCAs و 5 × 10⁵ RBMECs في وسط الخلايا البطانية ، مع استكمال مصل بقري جنيني بنسبة 5٪ ، ومكملات نمو الخلايا البطانية 1٪ ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (sECM). بذور RCAs في قارورة T175 في 20 مل sECM و RBMECs في قارورة T75 في 10 مل sECM.
      ملاحظة: يجب تعديل ممرات الذوبان والبذر ل RCAs و RBMECs من حيث كثافة الخلايا والوقت في الثقافة وفقا لعدد الظروف التجريبية التي سيتم اختبارها باستخدام نموذج BBB. من خلال البدء بقارورة واحدة من 1 × 10⁶ RCAs و 1 قارورة من 5 × 10⁵ RBMECs ، من الممكن الحصول على ما يصل إلى 20 إدراج BBB.
   2. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في جو مرطب لمدة 6 أيام تقريبا حتى التقاء حوالي 80٪ ل RCAs وأكثر من 90٪ من التقاء RBMECs. افصل الخلايا باستخدام محلول حمض التربسين -إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (التربسين-EDTA) (التربسين 1: 250) لمدة 5 دقائق (1 مل من التربسين لقوارير T75 و 2 مل لقوارير T175). أوقف نشاط التربسين باستخدام sECM (2: 1) ، وتعليق خلايا الطرد المركزي عند 750 × جم لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليق الكريات في 60 مل sECM.
   3. قسم RBMECs إلى 3 قوارير T175 واستزراعها في sECM لمدة 3 أيام أخرى قبل البذر على الإدخالات. احسب العدد الإجمالي ل RCAs الحية من خلال مراقبة تعليق الخلية المخفف بنسبة 1: 1 مع التربان الأزرق تحت المجهر البصري في غرفة بوركر.
2. بذر الخلايا على الإدخالات
   1. عالج جانبا واحدا من غشاء البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) المكون من 6 إدخالات شفافة متعددة الآبار مع بولي إل ليسين 100 ميكروغرام / مل والجانب الآخر بفيبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل ، للسماح بربط RCAs و BMECs. تعامل مع الإدخالات بالملاقط لتجنب ملامسة غشاء PET.
      1. ضع الإدخالات في صفيحة مكونة من 6 آبار وأضف محلول الفبرونيكتين (500 ميكرولتر على الأقل) في الغرفة العلوية. بعد ساعة واحدة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة محلول الفبرونيكتين ، وقم بإزالة الإدخالات من اللوحة متعددة الآبار وضعها رأسا على عقب في قاع طبق بتري مقاس 150 سم² ، والذي يستخدم هنا كدعم معقم للإدخالات المطلية بالفعل.
      2. أضف برفق 800 ميكرولتر من poly-L-lysine على الجانب السفلي من الملحق (كما هو موضح في الشكل 1A ؛ يشار إليه باسم بذر RCAs) ، واحتفظ بالمحلول على الإدخالات لمدة 1 ساعة في RT.
      3. قم بشفط المحلول واترك الإدخالات تجف عند RT لمدة 15-30 دقيقة. أصبحت الإدخالات جاهزة الآن لتلقيح الخلايا ولكن يمكن أيضا تخزينها في لوحة متعددة الآبار لعدة أيام عند 4 درجات مئوية قبل الشروع في بناء BBB.
         ملاحظة: تذكر أن تحتفظ بما لا يقل عن 3 إدخالات مطلية خالية من الخلايا لاستخدامها كعناصر تحكم للتحقق من صحة إنشاء BBB عن طريق قياسات تدفق FD40.
   بذور
   2. RCAs (35,000 / سم²) على الجانب السفلي من الإدخالات المطلية ب poly-L-lysine عن طريق إسقاط 800 ميكرولتر من تعليق الخلية على الملحق المقلوب (الشكل 1 أ). اترك تعليق RCA على الإدخالات لمدة 4 ساعات في RT للسماح بربط الخلايا بكفاءة بالغشاء.
   3. قم بشفط المحلول المتبقي ، ووضع الإدخالات في الآبار التي تحتوي على 2 مل من sECM ، وحافظ على اللوحة متعددة الآبار عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} في جو رطب ، وقم بتغيير sECM كل يومين.
   4. بعد 3 أيام ، عندما تقوم RCAs بتغطية الوجه السفلي للإدراج ، قم بزرع RBMECs على الجانب العلوي من الملحق ، باتباع الخطوات التالية:
      1. افصل RBMECs عن قوارير T175 واحسب إجمالي الخلايا الحية ، كما هو مذكور في الخطوتين 1.1.2 و 1.1.3.
      بذور
      2. RBMECs (60,000 / سم²) على السطح العلوي للإدخال في sECM (1,000 ميكرولتر) (الشكل 1 ب) ، وترك 3 إدخالات مع الخلايا النجمية فقط ، لاستخدامها كخلفية للمقاومة الكهربائية عبر البطانة (TEER). ضع اللوحة متعددة الآبار في ظروف الاستزراع القياسية. حافظ على النظام للزراعة لمدة 3 أيام على الأقل ، وقم بتغيير sECM في الغرفة الداخلية والسفلية كل يومين.

2. التحقق من صحة BBB

1. قياس TEER
   1. في اليوم الثالث من الزراعة المشتركة ، تحقق من TEER عن طريق إدخال الإدخالات الحاملة ل BBB في غرفة مناسبة (مع غطاء وحيث تحتوي كل من الغرفة والغطاء على زوج من الأقطاب الكهربائية المستشعرة للجهد والتيار) ، مملوءة ب 4 مل من sECM. اتصل بنسيج الظهارة فولت / أوممتر.
   2. جنبا إلى جنب مع قياسات TEER لأنظمة BBB الخلوية ، قم بتسجيل قيم TEER للإدخالات الثلاثة التي تحمل RCAs التي سيتم طرحها من القيم التي تم الحصول عليها باستخدام BBBs. اضرب قيم TEER الناتجة في سطح الملحق (4.2 سم²) للتعبير عن النتائج على أنها Ω × سم².
   3. من اليوم الثالث من الثقافة المشتركة ، قم بقياس TEER كل يوم. ملاحظه: بعد فترة أولية حيث يزداد TEER ، يجب أن تظل القيم المسجلة مستقرة لمدة يومين متتاليين على الأقل (عادة^{بين اليوم 5 و 7} من الثقافة المشتركة). عند هذه النقطة ، يكون BBB جاهزا للخطوة الثانية من التحقق من الصحة (القسم 2.2) و / أو لتجارب عبر BBB.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ الإجراء الموصوف في القسم 1.2 على نفس أنظمة BBB المكرسة لتجارب النفاذية التالية (القسم 3). تعمل في ظل ظروف معقمة.

< p class = "jove_title" >3. تخلل الفريتين المحمل ب FITC (FnN) عبر BBB

ملاحظة: متغير مؤتلف من الفيريتين البشري (Fn) ، يتم إنتاجه في الإشريكية القولونية ويتم تجميعه في أقفاص نانوية (FnN). يتم تحميل FnN بأيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC) ، ويتم تحديد تركيزات كل من Fn والجزيئات المحملة بدقة.

1. التدفق عبر BBB ل FITC و FITC-FnN
   1. قم بقياس تدفق FITC-FnN من الغرفة العلوية إلى الغرفة السفلية لنماذج BBB التي تم التحقق من صحتها (عادة في اليوم 5 - 7 من الزراعة المشتركة) ، مقارنة بالصبغة الحرة بعد 7 و 24 ساعة من الحضانة ، وفقا للخطوات التالية:
      1. أضف FITC-FnN (50 ميكروغرام / مل FnN ، 1.1 ميكرومتر FITC) أو كمية متساوية من FITC الحر في الغرفة العلوية لما لا يقل عن 6 أنظمة BBB لكل تركيبة ، من أجل سحب 2 مل من محلول sECM من الغرفة السفلية المكونة من 3 إدخالات على الأقل بعد 7 ساعات ، ومن الغرفة السفلية ل 3 إدخالات أخرى بعد 24 ساعة.
      2. قم بقياس شدة التألق البالغة 500 ميكرولتر من العينات التي تم جمعها بواسطة مقياس الطيف الفلوري (λ_ex 488 nm ، λ_em 515 nm ، شق 5).
      3. احصل على مضان الخلفية sECM عن طريق قياس 500 ميكرولتر من الوسط باستخدام نفس المعلمات التحليلية. اطرح مضان الخلفية sECM من جميع قيم مضان FITC أو FITC-FnN.
      4. حدد تركيز FITC أو FITC-FnN المتخلل من خلال مقارنة قيم التألق التي تم الحصول عليها مع منحنيين مختلفين للمعايرة يتم إنتاجهما بتركيزات معروفة (أي 6.87 ، 13.75 ، 27.5 ، 55 نانومتر) من الصبغة الحرة أو النانوية المذابة في 500 ميكرولتر sECM.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: بذر الخلايا على الإدخالات. إجراء البذر RCA (A) و RBMEC (B) على الجانبين المتقابلين لإدراج الألواح متعددة الآبار.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خلايا بطانة الأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفئران إينوبروت ص 10308 معزولة من أنسجة دماغ الفئران Sprague Dawley ، محفوظة بالتبريد عند الممر الأول وتسليمها مجمدة الخلايا النجمية القشرية إينوبروت ص 10202 معزولة من 2 أيام أنسجة دماغ الفئران ، محفوظة بالتبريد عند المرور الأول وتسليمها مجمدة. طقم الخلايا البطانية المتوسطة إينوبروت ص 60104 ECM (500 مل) ومصل بوفين الجنين (25 مل) ، مكمل نمو الخلايا البطانية (5 مل) والبنسلين / الستربتومايسين (5 مل). يسخن في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ويحفظ من الضوء التربسين EDTA بدون فينول أحمر EuroClone ECM0920D يسخن في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام فلورسين إيزوثيوسيانات ديكستران 40000 سيغما FD40S الحماية من الضوء محلول ملحي عازل للفوسفات من Dulbecco بدون Ca و Mg EuroClone ECB4004L تريتون X-100 سيغما تي 8787 ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 7906 مصل الماعز EuroClone ECS0200D بولي إل ليسين هيدروبروميد سيغما ص 1274 يمكن استخدام نفس الحل عدة مرات الفيبرونيكتين من بلازما الأبقار سيغما F1141 يمكن استخدام نفس الحل عدة مرات إدراج البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) صقر F3090 أغشية البولي إيثيلين تيريفثاليت الشفافة (PET) ؛ مساحة السطح: 4.2 سم 2 ؛ حجم المسام 0.4 ميكرومتر / مساحة السطح قارورة T75 Primo TC EuroClone ET7076 قارورة T175 Primo TC EuroClone ET7181 EVOM2 الأنسجة الظهارية فولت / أومتر العالمية للأدوات الدقيقة ألمانيا EVOM2 إندوم- كوب 24SNAP العالمية للأدوات الدقيقة ألمانيا إندوهم-24سناب مجهر ضوئي / مضان مع كاميرا لايكا مايكروسيستمز DM IL LED Fluo / ICC50 W وحدة الكاميرا مجهر مقلوب للخلايا الحية مع الكاميرا مجهر متحد البؤر لايكا مايكروسيستمز TCS SPE