قياس نشاط البروتيازوم في مقصورات مختلفة تحت الخلايا في دماغ الفئران

Abstract

المصدر: McFadden، T.، et al. قياس نشاط البروتيازوم اليوبيكويتين تحت الخلوي في دماغ القوارض. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو كيفية قياس نشاط البروتيازوم في مقصورات فرعية مختلفة من اللوزة الجانبية من أدمغة الفئران المكيفة بالخوف والتحكم فيها باستخدام مقايسة الببتيد الفلوري. يشق البروتيازوم ركيزة الببتيد الفلوروجينيك ، ويطلق جزيئات الفلورسنت ، والتي يتم قياسها كميا باستخدام قارئ الألواح لتقييم نشاط البروتيازوم في كسور البروتين النووي والمشبكي. يشير النشاط النووي المتزايد إلى تغييرات في التعبير الجيني ، بينما يشير انخفاض النشاط المشبكي إلى استقرار البروتين الضروري للحفاظ على الذاكرة على المدى الطويل.

Protocol

1. فحص نشاط البروتيازوم

ملاحظة: يمكن قياس نشاط البروتيازوم في أنسجة المخ المتجانسة باستخدام نسخة معدلة قليلا من مجموعة نشاط البروتيازوم 20S. لا يقيس هذا الاختبار بشكل مباشر نشاط مجمعات البروتيازوم الكاملة 26S. بدلا من ذلك ، فإنه يقيس نشاط نواة 20S ، مما يعني أنه يمكن أن يكون بمثابة وكيل لفهم نشاط النواة نفسها بدلا من مجمع البروتيازوم 26S بأكمله. ينخفض نجاح هذا الاختبار مع دورات التجميد والذوبان المتكررة و / أو زيادة مستويات المنظفات ، وخاصة الأيونية ، ويتطلب استخدام قارئ لوحة مع مجموعة مرشح 360/460 (الإثارة / الانبعاث) وقدرات تسخين تصل إلى 37 درجة مئوية.

1. إعدادات قارئ اللوحة: قم بالتسخين المسبق إلى 37 درجة مئوية واستمر طوال فترة التشغيل.​
   1. اضبط الإثارة على 360 والانبعاث على 460. إذا كانت لوحة البئر 96 المستخدمة واضحة ، فاضبط موضع البصريات على أسفل. إذا تم استخدام لوحة بئر 96 داكنة / سوداء ، فقم بتعيين موضع البصريات على الأعلى.
   2. قم بتعيين نماذج قارئ الألواح القديمة على Auto-Gain ضمن خيارات قراءة الفلورسنت ؛ تم ضبط الطرز الأحدث مسبقا لهذا الغرض. قم ببرمجة تشغيل حركي بزمن 2 ساعة ، ومسح (قراءة) كل 30 دقيقة.
2. أعد تكوين المخزن المؤقت للفحص 10x الموجود في المجموعة ب 13.5 مل من الماء فائق النقاء. أضف 14 ميكرولتر من 100 ملي مولار ATP إلى المخزن المؤقت الآن 1x ؛ هذا يعزز بشكل كبير نشاط البروتيازوم في العينات ويحسن موثوقية الفحص. يمكن تخزين المخزن المؤقت النهائي لفحص 20S على الجليد أو عند 4 درجات مئوية لحين الحاجة ويكون مستقرا لعدة أشهر.
3. أعد تكوين معيار AMC المقدم في المجموعة مع 100 ميكرولتر من DMSO. قم بتنفيذ هذه الخطوة في الظلام أو في ظروف الإضاءة المنخفضة ، حيث أن المعيار حساس للضوء.
4. قم بإنشاء منحنى قياسي ل AMC باستخدام المعيار المعاد تكوينه ، في الظلام أو في ظروف الإضاءة المنخفضة.
   1. في أنابيب منفصلة للطرد المركزي الدقيق سعة 0.5 مل ، أضف 16 و 8 و 6.4 و 3.2 و 1.6 و 0.8 و 0.4 و 0 ميكرولتر من معيار AMC ، والذي يتوافق مع تركيز AMC 20 و 10 و 8 و 4 و 2 و 1 و 0.5 و 0 ميكرومتر.
   2. إلى هذه الأنابيب، بالترتيب نفسه، أضف 84 و92 و93.6 و96.8 و98.4 و99.2 و99.6 و100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص 20S. يؤدي هذا إلى إنشاء سلسلة من تركيزات AMC العالية إلى المنخفضة ، والتي سيتم استخدامها لمعايرة قارئ الألواح وتحليل نشاط البروتيازوم في العينات المتجانسة.
   3. قم بتخزين جميع المعايير المخففة على الثلج في الظلام لحين الحاجة.
5. أعد تكوين ركيزة البروتيازوم (Suc-LLVY-AMC) المتوفرة في مجموعة مع 65 ميكرولتر من DMSO. قم بتنفيذ هذه الخطوة في الظلام أو في ظروف الإضاءة المنخفضة ، لأن الركيزة حساسة للضوء. قم بإنشاء تخفيف بنسبة 1:20 لركيزة البروتيازوم في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل باستخدام المخزن المؤقت لفحص 20S. قم بتخزين الركيزة المخففة على الثلج في الظلام لحين الحاجة.
   ملاحظه: على سبيل المثال ، إذا كانت اللوحة ستحتوي على 10 عينات و 1 فارغة ، فستحتاج إلى ركيزة مخففة كافية ل 22 بئرا (مع تكرارات) عند 10 ميكرولتر لكل بئر. وهذا يعادل 220 ميكرولتر + 30 ميكرولتر لأخطاء سحب العينات، مما يتطلب 12.5 ميكرولتر من الركيزة و237.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص 20 ثانية.
6. قم بإذابة العينات المرغوبة (إذا كانت مجمدة) وأضف كمية طبيعية إلى طبق 96 جيدا. قم بتشغيل كل عينة في نسخ مكررة. تختلف كمية العينة المطلوبة بناء على تحضير الأنسجة. بشكل عام ، 10-20 ميكروغرام كافية لأي جزء تحت الخلوي.
7. ارفع حجم بئر العينة إلى 80 ميكرولتر بالماء عالي النقاء. يعتمد المبلغ المضاف على حجم العينة المضافة. على سبيل المثال ، إذا كانت العينة 1 تحتوي على 4.5 ميكرولتر من البروتين والعينة 2 كانت 8.7 ميكرولتر ، فإن كمية الماء المطلوبة ستكون 75.5 ميكرولتر و 71.3 ميكرولتر على التوالي. في بئرين منفصلين ، أضف 80 ميكرولتر من الماء وحده ؛ ستكون هذه هي فراغات الفحص.
   ملاحظه: من أجل الحد من التغيرات في حجم البروتين بسبب أخطاء سحب العينات، يمكن تطبيع تركيزات البروتين إلى العينة الأقل تركيزا. سيسمح ذلك باستخدام نفس حجم العينة في جميع الظروف.
8. أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص 20S إلى كل بئر ، بما في ذلك فراغات الفحص. يوصى هنا باستخدام مكرر / ماصة آلية لضمان حجم الفحص المتسق عبر الآبار.
9. اختياري: في هذه المرحلة ، أدخل التلاعب في المختبر إذا رغبت في ذلك ؛ سيتطلب ذلك أن تحتوي كل عينة على بئرين إضافيين لكل معالجة ، بما في ذلك السيارة. إذا كان الأمر كذلك ، أضف 5-10 ميكرولتر من الدواء / المركب ذي الأهمية إلى 2 من آبار العينة وحجم مكافئ من التحكم / السيارة إلى بئرين آخرين. ضع اللوحة على قارئ الألواح المسخن مسبقا أو في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
10. أطفئ الأنوار أو ادخل إلى غرفة مظلمة. أضف كل 100 ميكرولتر من معايير AMC المخففة إلى بئر جديد ؛ سيكون لكل معيار بئر واحد.
11. في الظلام ، أضف 10 ميكرولتر من ركيزة البروتيازوم المخففة إلى الآبار التي تحتوي على عينة وفراغات الفحص ، ولكن ليس إلى معيار AMC. يوصى هنا باستخدام مكرر / ماصة آلية لضمان حجم الفحص المتسق عبر الآبار.
12. ضع اللوحة في قارئ اللوحة وابدأ التشغيل الحركي.
    ملاحظه: لا تحتاج اللوحة إلى أن تكون تحت الإثارة المستمرة أثناء التشغيل الحركي ، ومع ذلك ، يمكن للمستخدم الاختيار إذا رغبت في
ذلك
13. في نهاية التشغيل الحركي، قم بتصدير قيم الفلورسنت الخام 360/460 إلى Microsoft Excel.
    1. متوسط الآبار المكررة معا لكل معيار ، كل عينة و Assay Blank لجميع عمليات المسح الخمسة يجب أن تزداد قيم الفلورسنت الخام عبر عمليات المسح للعينات ولكنها تظل مستقرة (أو تنخفض قليلا) للمعايير وفراغات الفحص.
    2. خذ أعلى متوسط بئر معيار AMC واقسمه على التركيز المعروف (20 ميكرومتر). اقسم هذه القيمة على تركيز العينة المستخدم في المقايسة للحصول على قيمة AMC موحدة. لكل عينة ومتوسط الفحص الفارغ، اقسم على قيمة AMC الموحدة.
    3. خذ هذه القيمة النهائية واقسمها على تركيز العينة المستخدم في المقايسة للحصول على القيمة الطبيعية لكل عينة وفارغة المقايسة. افعل هذا لجميع عمليات المسح ال 5.
    4. اطرح قيمة الفحص الفارغ العادية من كل قيمة عينة عادية لجميع عمليات الفحص ال 5.

Materials