قياس نشاط البروتيازوم في مقصورات مختلفة تحت الخلايا في دماغ الفئران

الملخص

المصدر: McFadden، T.، et al. قياس نشاط البروتيازوم اليوبيكويتين تحت الخلوي في دماغ القوارض. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو كيفية قياس نشاط البروتيازوم في مقصورات فرعية مختلفة من اللوزة الجانبية من أدمغة الفئران المكيفة بالخوف والتحكم فيها باستخدام مقايسة الببتيد الفلوري. يشق البروتيازوم ركيزة الببتيد الفلوروجينيك ، ويطلق جزيئات الفلورسنت ، والتي يتم قياسها كميا باستخدام قارئ الألواح لتقييم نشاط البروتيازوم في كسور البروتين النووي والمشبكي. يشير النشاط النووي المتزايد إلى تغييرات في التعبير الجيني ، بينما يشير انخفاض النشاط المشبكي إلى استقرار البروتين الضروري للحفاظ على الذاكرة على المدى الطويل.

البروتوكول

1. فحص نشاط البروتيازوم

ملاحظة: يمكن قياس نشاط البروتيازوم في أنسجة المخ المتجانسة باستخدام نسخة معدلة قليلا من مجموعة نشاط البروتيازوم 20S. لا يقيس هذا الاختبار بشكل مباشر نشاط مجمعات البروتيازوم الكاملة 26S. بدلا من ذلك ، فإنه يقيس نشاط نواة 20S ، مما يعني أنه يمكن أن يكون بمثابة وكيل لفهم نشاط النواة نفسها بدلا من مجمع البروتيازوم 26S بأكمله. ينخفض نجاح هذا الاختبار مع دورات التجميد والذوبان المتكررة و / أو زيادة مستويات المنظفات ، وخاصة الأيونية ، ويتطلب استخدام قارئ لوحة مع مجموعة مرشح 360/460 (الإثارة / الانبعاث) وقدرات تسخين تصل إلى 37 درجة مئوية.

1. إعدادات قارئ اللوحة: قم بال....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 20S طقم نشاط البروتيازوم ميليبور سيجما APT280 يحمل البائعون الآخرون إصدارات مختلفة ATP صياد FERR1441 بائعين آخرين مختلفين قارئ لوحة BioTek Synergy H1 بيوتك VATECHH1MT3 يحمل البائعون الآخرون إصدارات مختلفة مثبط الإنزيم البروتيني ميليبور سيجما ص 8340 بائعين آخرين مختلفين DMSO DMSO د8418 بائعين آخرين مختلفين