الحصول على معلقات الخلايا من أنسجة دماغ الفأر الإقفارية

الملخص

المصدر: Pösel, C., et al. التحليل الخلوي للعزل والتدفق للخلايا المناعية من دماغ الفأر الإقفاري. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو إجراء عزل خلايا الدماغ والخلايا المناعية المتسللة من أنسجة دماغ الفئران الإقفارية عن طريق الهضم الأنزيمي ، متبوعا بإزالة بقايا الخلايا والمايلين عن طريق الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، لدراسة استجابات الالتهاب في أبحاث السكتة الدماغية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل المراجعة الأخلاقية المناسبة للحيوانات.

1. تحضير الكواشف

1. عازلة الهضم (1 مل لكل نصف الكرة الأرضية): قم بإذابة خليط موحد من الإنزيمات الهاضمة المنقاة ، على سبيل المثال ، Liberase بتركيز منخفض من الثيرموليسين (TL) إلى تركيز 2U / ml في محلول الملح المتوازن Hanks (HBSS) الذي يحتوي على الكالسيوم (Ca) والمغنيسيوم (Mg).
2. مخزن الغسيل باستخدام DNAse: قم بإذابة DNAse I بتركيز 666 وتار/مل في HBSS (خالي من الكالسيوم/المغنيسيوم) الذي يحتوي على 10٪ من مصل ربلة الساق الجنينية (FCS).
3. مخزن الغسيل بدون DNAse: HBSS (خال من Ca / Mg) يحتوي على 10٪ من FCS.
4. وسط تدرج الكثافة (5 مل لكل نصف كرة): تحضير وسط تدرج كثافة متساوي التوتر (SIP ؛ 100٪) عن طريق خلط تسعة أجزاء من وسط تدرج الكثافة مع جزء واحد من كلوريد الصوديوم 1.5 M. قم بتخفيف SIP إلى كثافة 25٪ عن طريق إضافة حجم مناسب من HBSS (خال من Ca / Mg) يحتوي على 3٪ من FCS.

فئة

2. تفكك الأنسجة الدماغية إلى معلقات خلية واحدة

1. قم بإزالة جذع الدماغ والمخيخ بعناية بشفرة حلاقة نظيفة. استخدم شفرة حلاقة نظيفة لتقطيع الدماغ وقطع كل نصف كرة على طول المستوى الإكليلي إلى ثلاث قطع متساوية الحجم تقريبا.
2. قم بتقطيع الأنسجة المفرومة لكل نصف كرة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر باستخدام نهاية المكبس لحقنة سعة 5 مل. اشطف مصفاة الخلية باستمرار باستخدام HBSS المثلج (+ Ca / Mg). قم بتخزين العينات المتجانسة على الثلج.
3. جهاز طرد مركزي عند 286 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، تخلص من المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من عازلة الهضم وانقل المعلق إلى أنبوب 2 مل. احتضان التعليق تحت دوران مستمر بطيء عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
4. غربلة معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر واشطفها جيدا باستخدام 3 مل من محلول الغسيل الذي يحتوي على DNAse متبوعا ب 15 مل من محلول الغسيل الخالي من الحمض النووي. جهاز طرد مركزي عند 286 × جم و 18 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. ملاحظه: يزيل استخدام DNAse مخاط الحمض النووي الناجم عن تحلل الخلايا ، مما قد يؤدي إلى تراكم الخلايا ، مما يضر ببقاء الخلية.

فئة

3. الطرد المركزي المتدرج للكثافة لإزالة المايلين وحطام الخلية

1. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط تدرج الكثافة 25٪ وماصة التعليق إلى أنبوب 15 مل. امزج جيدا عن طريق سحب العينات المتكرر واللطيف ، مع تجنب تكون الفقاعات. ملاحظه: يجب استخدام وسط تدرج الكثافة في RT لمنع تكتل الخلايا.
2. جهاز طرد مركزي عند 521 × جم و 18 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدم أقل ملف تعريف تسارع للدوار واترك الدوار يتوقف بدون فرامل. قم بإزالة الأنابيب برفق من جهاز الطرد المركزي دون اهتزاز. استنشق بعناية طبقة المايلين والمادة الطافية مع الحفاظ على حبيبات الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب. ملاحظه: تأكد من إزالة طبقة المايلين بالكامل ، لأن أي بقايا ستضعف تحليل التدفق الخلوي.
3. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من محلول الغسيل الخالي من الحمض النووي وماصة التعليق في أنبوب جديد سعة 15 مل. ملاحظه: تعد خطوة الغسيل هذه أمرا بالغ الأهمية لأن الإزالة الكافية لوسط تدرج الكثافة تساهم بشكل كبير في كمية ونوعية عينة الخلية النهائية.
4. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 286 × جم و 10 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل البارد وحدد عدد الخلايا وقابليتها للبقاء عن طريق استبعاد التريبان الأزرق في مقياس كثافة الدم. قم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية وقم بمعالجتها بسرعة.

المواد