تحريض خلل الحركة الناجم عن ليفودوبا في نموذج الفئران لمرض باركنسون

الملخص

المصدر: Caulfield، M. E.، et al. تحريض وتقييم خلل الحركة الناجم عن الليفودوبا في نموذج الفئران لمرض باركنسون. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو عملية إحداث خلل الحركة الناجم عن الليفودوبا في نموذج الفئران المبتلا بمرض باركنسون عن طريق إعطاء ليفودوبا جنبا إلى جنب مع مثبط تحويل الدوبامين. الحقن المتكررة تفرط في تحفيز الخلايا العصبية في الدماغ, مما يؤدي إلى خلل وظيفي حركي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف والإمدادات

1. تحديد L-3،4-ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين ميثيل هيدروكلوريد (ليفودوبا أو L-DOPA) وهيدروكلوريد البنسيرازيد ، وهو مثبط ديكاربوكسيلاز محيطي (انظر جدول المواد) جرعة ، وتردد التصنيف ، والجدول الزمني التجريبي المناسب للسؤال البحثي (الشكل 1).
   ملاحظه: يمكن طرح الأسئلة البحثية للبحث عن أي عدد من الإجابات ، بدءا من السؤال عما إذا كان العلاج المحدد قد يقلل من خلل الحركة الناجم عن L-DOPA (LID) إلى منع تحريض LID. يمكنهم أيضا استكشاف ما إذا كانت الفعالية العلاجية تعتمد على جرعة ليفودوبا أو ما إذا كان تعبير LID و / أو الفعالية العلاجية يختلف اعتمادا على جنس الموضوع ونوعه وعمره.
2. قم بوزن الفئران أسبوعيا لحساب كمية الدواء المناسبة بناء على تغيرات الوزن المستمرة أثناء الدراسة.
   ملاحظه: بسبب زيادة النشاط في الفئران LID +, هناك إمكانية لفقدان الوزن مع العلاجات طويلة الأجل L-DOPA. في حالة حدوث فقدان للوزن ، قم بتزويد الفئران بوجبات كاملة من الناحية التغذوية ومستساغة للغاية (انظر جدول المواد) بعد حقن L-DOPA.
3. احسب كمية L-DOPA والبنسيرازيد المطلوبة لكل تركيز أسبوعي ، وقم بوزن الكميات المجففة بالتجميد لكل يوم من الحقن وتخزينها معا لمدة 1-2 أسابيع عند -20 درجة مئوية في قوارير كهرمانية زجاجية حتى يوم العلاج.
   ملاحظه: الجرعة المستهدفة هي 12 ملغ/كغ أو 12 ملغ-دوبا/1000 غرام من وزن الجسم. تقدم المعلومات التكميلية مثالا على الحسابات لتحديد كمية L-DOPA والمحلول الملحي اللازم لكل يوم من أيام الأسبوع باستخدام 12 مجم L-DOPA / كجم من وزن الجسم بحجم حقن 1 سم مكعب / كجم من وزن الفئران.

2. إعداد الغرفة والقفص

1. في اليوم الأول من علاج L-DOPA 3-4 أسابيع بعد 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA) جراحة الآفة, نقل الفئران إلى سكن واحد, بما في ذلك التخصيب المعتمد من IACUC.
2. حافظ على السكن الفردي طوال الدراسة لتجنب تدخل الأقران في التقييمات السلوكية.
3. في أيام تصنيف LID ، ضع أقفاص المنزل على رف من الأسلاك الفولاذية ، بزاوية 45 درجة تقريبا للحصول على الرؤية المثلى للفأر (الشكل 2 أ). اقلب علامات التعريف (الشكل 2 ب) لأعلى وقم بإزالة زجاجات المياه ورفوف الطعام وجميع أنواع التخصيب في القفص (الشكل 2 ج) لتجنب التدخل في التقييمات السلوكية.

فئة < ص = "jove_title" >3. حقن ليفودوبا وتصنيف خلل الحركة

1. الحقن تحت الجلد من لدوبا
   1. مباشرة قبل الحقن اليومي ل L-DOPA ، أضف الحجم المناسب من المحلول الملحي المعقم إلى مزيج L-DOPA المجفف بالتجميد وبينسيرازيد المثقف مسبقا في قارورة العنبر ورجها جيدا لمدة 10 ثوان (الخطوة 1.3).
      ملاحظة: حجم الحقن المستهدف هو 1 مل/1000 غرام من وزن الجسم (مع 12 ملجم ل-دوبا لكل مل). يعتمد حجم المحلول الملحي المعقم على عدد لكل دراسة.
   2. املأ المحاقن الفردية (على سبيل المثال ، 1.0 أو 0.5 مل بإبرة 26 جم) بالحجم المطلوب لكل (1 مل / كجم من وزن الفئران) وقم بتسمية كل حقنة بتعريف حيواني فردي.
      ملاحظه: احتفظ بالمحاقن المملوءة محمية من الضوء في أكياس معقمة حتى وقت الحقن. يتأكسد L-DOPA بسرعة في وجود الأكسجين والضوء في بيئة مائية.
   3. أحضر القفص الأول إلى مقعد الحقن.
   4. أخرج الجرذ من قفصه وضعه على سطح الحقن.
   5. كبح الرأس والكتفين برفق على السطح الذي يستريح عليه الجرذ براحة اليد غير المهيمنة.
   قم
   6. بفرش الجلد الموجود على الظهر برفق مع تغطية لوح الكتف بإبهام والسبابة من اليد غير المهيمنة. ثم, حقن حجم لدوبا مع اليد المهيمنة في الفضاء تحت الجلد بين/تحت الأصابع, الحفاظ على الإبرة موازية للجسم قدر الإمكان لتجنب الحقن العضلي.
      ملاحظه: لا يتم تخدير الفئران قبل الحقن.
   7. تخلص من كل حقنة فردية مستخدمة في وعاء حاد.
   8. استبدل الجرذ في قفصه الفردي وأضف علاجات كاملة من الناحية التغذوية باستثناء أيام تصنيف LID لتجنب التدخل في التقييمات السلوكية حتى بعد اكتمال التقييمات.
   9. اضبط المؤقت لمدة 1-2 دقيقة حسب وقت التصنيف المطلوب وعدد الفئران في الدراسة في أيام التصنيف. استرجع القفص التالي وحقن الجرذ التالي عندما يشير المؤقت.
   10. كرر ذلك ، مع حقن فأر واحد كل 1-2 دقيقة ، حتى يتم حقن جميع الفئران.
تصنيف
2. خلل الحركة الناجم عن ليفودوبا بعد الحقن
   1. قم بتقييم الشدة (الجدول 1) والتكرار (الجدول 2) لحركات خلل الحركة وفرط الحركة في العدد المطلوب من النقاط الزمنية ، والتي يجب أن تشمل البداية الأولية لسلوك LID ، وسلوك الذروة ، ومرحلة الانخفاض.
   2. بالنسبة للذكور والإناث البالغين Sprague Dawley أو Fisher 344 الفئران ، وحجم عينة N = 40 فأرا ، ابدأ تصنيفات خلل الحركة بعد 20 دقيقة من حقن L-DOPA الأول ، ثم على فترات 50 دقيقة حتى 220 أو 270 دقيقة بعد الحقن ، اعتمادا على الوقت الذي توقفت فيه سلوكيات LID في 90٪ -100٪ من الفئران.
   3. إذا كنت تستخدم فواصل زمنية للتصنيف لمدة دقيقة واحدة ، اضبط مؤقتا لمدة دقيقة واحدة. انتقل إلى الجرذ التالي وقم بتقييمه لمدة 1 دقيقة. استمر في جميع الفئران ، وتصنيف لمدة 1 دقيقة.
   4. ضع مؤقتا بجوار القفص بشكل واضح بحيث يمكن ملاحظة شدة سلوك LID (الجدول 1) أثناء تقدير تكرار أي سلوك معين (الجدول 2) خلال فترة التصنيف.
   5. بعد اكتمال التصنيفات لأول نقطة زمنية ، ابدأ مرة أخرى بالجرذ الأول في النقطة الزمنية التالية (على سبيل المثال ، 70 دقيقة بعد الحقن) واستمر في الفاصل الزمني المطلوب (على سبيل المثال ، كل 50 دقيقة) حتى تكتمل جميع النقاط ><الزمنية. ملاحظه: نظرا لتداخل حقن L-DOPA ومهام تصنيف LID, هناك حاجة إلى شخصين في أيام التصنيف, واحد للحقن والآخر للتصنيفات السلوكية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: مثال على الجدول الزمني للعلاج. مثال على الجدول الزمني لجرعة تصاعد L-DOPA من 12 أسابيع في الطول الإجمالي, مع 8 أسابيع من حقن L-DOPA تبدأ 3 أسابيع بعد 6-OHDA الآفة و 4 أسابيع بعد العلاج التجريبي. في هذا المثال, يتم حقن L-DOPA تحت الجلد 5x في الأسبوع (الاثنين – الجمعة) في نفس الوقت تقريبا كل يوم, لمدة أسبوعين في كل جرعة موصوفة L-DOPA (3, 6, 9, و 12 ملغ/كغ). التقييمات LID السلوكية تجر...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مؤقت رقمي 100 دقيقة ستابلز 1111764 مقياس البوصلة CX المضغوط أوهاوس 30428202 5- (2-أمينوإيثيل) -1،2،4-بنزينتريول ، أحادي هيدروبروميد كيماويات كايمان هاتف: 25330 6-OHDA هو سم عصبي كاتيكولامينرجي يستخدم للحث على آفات الدوبامين وأعراض باركنسون في القوارض. أقفاص ألينتاون ألينتاون ، ذ م م جرذان900 توفر أقفاص Allentown القدرة على رؤية الفئران من جميع الجهات. صواني BD لأخصائي الحساسية بإبرة متصلة بشكل دائم دينار بحريني 305540 د.ب لحقن L-DOPA تحت الجلد هيدروكلوريد بينسيرازيد سيجما ألدريتش ب 7283 Benserazide هو مثبط ديكاربوكسيلاز محيطي يستخدم مع L-DOPA للحث على خلل الحركة في نماذج القوارض من مرض باركنسون. قوارير زجاجية من العنبر الترمو: العلمية ب 7921 يستخدم لتخزين L-DOPA / benserazide عند -20 درجة مئوية حتى يختلط مع محلول ملحي معقم. L-3،4-ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين إستر ميثيل هيدروكلوريد سيجما ألدريتش د1507 L-3،4-ديهيدروكسي فينيل ألانين إستر الميثيل هو مقدمة ل لدوبا التي تعبر الحاجز الدموي الدماغوتستخدم لعلاج أعراض باركنسون في القوارض. أقلام رصاص ميكانيكية ماتي ورقة ماتي ستابلز هاتف: 107250 علاجات التخصيب الغذائي الكامل للقوارض بيو سيرف F05478 دلو ثلج دائري مع غطاء, 2.5 لتر كورنينج 432129 الحافظة البلاستيكية القياسية ستابلز 1227770 وحدات رفوف متحركة طويلة من الصلب 6 بوصات أولين H9488 يمكن تعديل العرض / الارتفاع حسب الحاجة / عدد الفئران لكل تجربة محلول ملحي معقم 0.9٪ كوفيديان / أرجيل 1020 للخلط مع L-DOPA / bens