الكشف عن شيخوخة الخلايا العصبية في قسم العضوية القشرية

الملخص

المصدر: Shaker، M. R.، et al. جيل قوي وقابل للتكرار بدرجة كبيرة من عضيات الدماغ القشرية لنمذجة الشيخوخة العصبية في المختبر. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو طريقة الكشف عن الخلايا العصبية المتقدمة في السن في الأقسام العضوية القشرية عن طريق تلطيخ نشاط بيتا جالاكتوزيداز ، والذي يرتفع في الخلايا القديمة. يشق الإنزيم ركيزة لإنتاج منتج أزرق ، متبوعا بمراقبة مجهرية للخلايا العصبية الملطخة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. توصيف الشيخوخة العصبية في العضيات القشرية

1. معالجة العضيات القشرية للعمليات بالتبريد:
   ملاحظه: تم تنفيذ الخطوات في غطاء السلامة البيولوجية من الفئة 2.
   1. قم بإعداد أنابيب 2 مل ، كل منها مملوء ب 1.5 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA).
   2. قم بقص نهاية طرف ماصة P1000 (لجعلها ذات تجويف عريض) وانقل كل مادة عضوية برفق إلى أحد أنابيب 2 مل المحضرة أعلاه (عضوية واحدة لكل أنبوب).
      ملاحظه: لمنع اختلاط وسائط وسيط التمايز الزائد (DM) مع PFA، اسمح للمادة العضوية بالغرق باتجاه فتحة طرف الماصة P1000 ووضع الطرف فوق الجزء العلوي من PFA مباشرة في الأنبوب قبل سحب الوسيط العضوي للخارج. سيمكن هذا الباحث من نقل الوسائط العضوية والحد الأدنى جدا من الوسائط فقط.
   3. اسمح لعملية التثبيت بإجراء عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
   4. باستخدام طرف ماصة P1000 غير مقطوع، قم بشفط PFA الزائد بعناية وأضف 1.5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات.
   5. انقل الأنابيب إلى شاكر مداري مثبت على 70 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
   6. كرر عملية الغسيل مع 1x PBS البارد ثلاث مرات للتأكد من إزالة جميع PFA تماما.
      ملاحظه: لا تتخلص من PFA في حاويات النفايات العادية. بدلا من ذلك ، قم بإعداد حاوية محددة للتخلص من النفايات الكيميائية لهذا الغرض ، لأن PFA يمثل خطرا.
   7. اغمر العضيات في 1x PBS يحتوي على 30٪ سكروز واحتضانه عند 4 درجات مئوية حتى تغرق جميع العضيات في قاع الأنبوب.
      ملاحظه: يعتمد الوقت اللازم لتغرق العضيات على حجمها وعمرها. قد تستغرق العضيات البالغة من العمر ثلاثة أشهر ما يصل إلى 5 ساعات.
   8. باستخدام طرف ماصة P1000 عريض التجويف، انقل برفق ثلاثة إلى خمسة عضويات إلى قالب تركيب يحتوي على محلول تركيب مصنوع من 30٪ من السكروز ودرجة حرارة القطع المثلى (OCT) بنسبة 3:2.
   9. استخدم طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر بمساعدة مجهر مجسمة لتوجيه العضيات ووضعها في نمط يشبه الشبكة.
   10. ضع القالب على الثلج الجاف لترسيخ محلول OCT للسكروز قبل الشروع في التقسيم بالتبريد (16-20 ميكرومتر) باستخدام جهاز التبريد.
       ملاحظه: بالنسبة لبيتا جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ، يجب معالجة جميع الأنسجة للتقسيم بمجرد غرقها. بالنسبة للتألق المناعي ، يمكن معالجة الأنسجة للتقسيم في اليوم التالي. إذا لم يتم تلطيخها على الفور ، فيجب تخزين جميع الشرائح التي تحتوي على أقسام عند -20 درجة مئوية قبل التألق المناعي اللاحق أو بيتا جالاكتوزيداز.
2. عملية تحليل الشيخوخة في عضيات الدماغ القشرية:
   ملاحظه: يمكن تنفيذ الخطوات التالية على مقعد مختبر عادي.
   1. انقل الشرائح إلى وعاء تلطيخ منزلق مجهر بغطاء واغسل الأنسجة العضوية المقطعة ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 10 دقائق في RT لإزالة أي محلول تركيب زائد.
   2. بعد ذلك ، احتضان الأنسجة المغسولة بمحلول تلطيخ بيتا جالاكتوزيداز الطازج طوال الليل عند 37 درجة مئوية < برميل / > ملاحظه: يتكون محلول تلطيخ بيتا جالاكتوزيداز من عازلة الفوسفات (ل 10 مل من محلول الفوسفات: 8.15 مل من 1 M NaH₂PO₄ ، 1.85 مل من 1M Na₂HPO₄) الأس الهيدروجيني المعدل = 6 ، 100 ملي مولار من سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (III) ، 100 ملي مولار من سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (II) ثلاثي الهيدرات ، 5 م من كلوريد الصوديوم ، 1 م من MgCl₂ ، 20 مجم / مل من X-Gal. تجنب استخدام حاضنة زراعة الخلايا القياسية التي تحتوي على ثاني أكسيد الكربون₂ لأن ثاني أكسيد الكربون₂ سيغير درجة الحموضة لمحلول تلطيخ بيتا جالاكتوزيداز.
   3. لإزالة محلول بيتا جالاكتوزيداز ، اغسل الأنسجة الملطخة باستخدام 1x PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في RT.
   4. قم بتركيب المناديل المغسولة بحامل زجاجي مضاد للبهتان واترك محلول التركيب يتجمد لمدة 30 دقيقة عند RT قبل عرضه تحت المجهر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
16٪ فورمالديهايد (W/V) خال من الميثانول	ثيرمو فيشر العلمي	28908	يتم تخفيف 4٪ من PFA في 1x PBS
مجهر CKX53 بكاميرا SC50	أوليمبوس
محلول ملحي مخزن للفوسفات من دولبيكو	سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة	D1408-500ML
الوسط العصبي القاعدي	ثيرمو فيشر العلمي	21103049	تستخدم في وسائط DM
OCT تضمين مركب ساكورا شفاف (118 مل / زجاجة)	الأنسجة تك	4583
سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (II) ثلاثي هيدرات	سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة	CP1087
سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (III)	سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة	455946
إطالة حامل الزجاج المضاد للتلاشي	لايف تكنولوجيز أستراليا (TFS)	P36980
السكروز	سيجما ألدريتش بي تي واي المحدودة	PHR1001-1G	يتم تخفيف 30٪ من السكروز في 1x PBS