$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. تحضير محلول Lysophosphatidylcholine (LPC)
- قم بإذابة 25 مجم من مسحوق LPC (انظر جدول المواد) مع 250 ميكرولتر من محلول الكلوروفورم والميثانول المختلط (1: 1) لصنع محلول LPC بنسبة 10٪ ونقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر.
ملاحظة: إذا لم يتم إذابة LPC تماما ، فضع أنبوب الطرد المركزي في منظف بالموجات فوق الصوتية وقم بالموجات فوق الصوتية عند 40 كيلو هرتز لمدة ~ 1 ساعة للحصول على حل موحد.
- قسم المحلول إلى 3 ميكرولتر / أنبوب واحفظه عند -80 درجة مئوية
ملاحظة: يمكن تخزين الحل لمدة ~ 2 سنوات.
- قبل الجراحة ، قم بتخفيف المحلول (الخطوة 1.2) ب 27 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ (NaCl) ، واحتفظ بالمحلول في حمام مائي بدرجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية
ملاحظة: تحضير المحلول قبل بدء الحقن مباشرة.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. التحضير الجراحي
- استخدم إبرة 32 جم ، 2 بوصة للتوصيل بحقنة 5 ميكرولتر (انظر جدول المواد). تأكد من عدم وجود حقنة ميكرولتر دون عائق. اسحب 5 ميكرولتر من محلول LPC لتحضير الحقن.
- قم بتخدير الفأر في غرفة حث متصلة بمبخر إيزوفلوران مع 3٪ إيزوفلوران ممزوج بأكسجين 100٪ بمعدل حوالي 0.3 لتر / دقيقة.
- تأكد من عمق التخدير من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم أثناء التنفس السلس.
- احلق رأس الماوس بين الأذنين باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. ضع قطرات العين المرطبة لمنع جفاف القرنية أثناء العملية.
- بعد ذلك ، ضع الماوس في إطار تجسيمي (انظر جدول المواد) مع الجانب الظهري لأعلى ، وقم بتأمين الرأس بمخروط الأنف ومشبك الأسنان. حافظ على التخدير مع 1.2٪ -1.6٪ أيزوفلوران من خلال أنفه.
ملاحظه: يمكن تعديل تركيز الأيزوفلوران وفقا لحالة الجهاز التنفسي للفئران.
< ص الفئة = "jove_title" >
3. الإجراء الجراحي
ملاحظة: يتم وضع على وسادة تدفئة أثناء جميع الإجراءات.
- ثبت الماوس على الجهاز التجسيمي مع قضبان الأذن الثنائية. تأكد من أن قضبان الأذن مستوية وأن الرأس أفقي ومستقر.
- تطهير جلد الرأس عن طريق مسحه عدة مرات باليودوفور ، متبوعا بالكحول بحركة دائرية. بعد ذلك ، يتم استخدام مشرط لقطع شق صغير يبلغ طوله حوالي 1.5 سم على طول خط الوسط لفروة الرأس لكشف الجمجمة.
- امسح الجمجمة بقطعة قطن مغموسة في بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 1٪ حتى تنكشف البريجما واللامدا واليافوخ الخلفي. ضع المحقنة على الجهاز التجسيمي.
ملاحظة: استخدم بيروكسيد الهيدروجين بحذر وتجنب لمس الأنسجة المحيطة.
- تأكد من الوضع الأفقي لرأس (الأمامي والخلفي واليسار واليمين).
- اضبط مقبض المحور Z للإطار التجسيمي بحيث يلمس طرف الإبرة والجمجمة دون الانحناء ، ثم قم بقياس إحداثيات المحور Z. تحقق من إحداثيات Z للبريجما واليافوخ الخلفي.
- اضبط شريط الأذن بحيث لا يزيد الفرق بين إحداثيات Z للبريجما واليافوخ الخلفي عن 0.02 مم. بعد ذلك ، اتبع نفس الطريقة لقياس إحداثيات Z للمواضع المقابلة على الجانبين الأيسر والأيمن من خط الوسط. اضبط شريط الأذن للتأكد من أن اليسار واليمين على نفس المستوى.
- حدد موقع الجسم الثفني. اضبط أصل XYZ على bregma.
ملاحظة: موقع الحقن الأول هو 1.0 مم جانبي إلى بريجما, 2.4 مم عمق, و 1.1 مم الأمامي. موقع الحقن الثاني هو 1.0 مم جانبي للبريجما ، وعمق 2.1 مم ، و 0.6 مم أمامي. على سبيل المثال ، إحداثيات البريجما هي (0،0،0). قم بقياس إحداثيات Z للموقع المقابل المميز على أنه (-1 ، 1.1 ، X) و (-1 ، 0.6 ، Y). يمكن تحديد إحداثيات موقع الحقن الأول للجسم الثفني هو (-1 ، 1.1 ، − [X + 2.4]) ، وموقع الحقن الثاني هو (-1 ، 0.6 ، − [Y + 2.1]).
- بمجرد تحديد موقع الحقن ، ضع علامة بعلامة معقمة على الجمجمة وسجل الإحداثيات.
- قم بحفر الموقع المحدد برفق باستخدام مثقاب الجمجمة (انظر جدول المواد). احرص على تجنب أي نزيف.
- حرك الإبرة ببطء إلى الإحداثيات المحددة وابدأ الحقن. للحث على إزالة الميالين من الجسم الثفني ، قم بحقن 2 ميكرولتر من محلول LPC (الخطوة 1.2) في كل موقع حقن (الخطوة 3.5.) بمعدل 0.4 ميكرولتر / دقيقة.
- بعد الحقن ، احتفظ بالإبرة في كل موقع لمدة 10 دقائق إضافية < br / >
ملاحظة: تأكد من أن الفاصل الزمني بين حقنتين لا يزيد عن 20 دقيقة.
- خياطة الجلد بخياطة 4-0 وانتظر حتى يستيقظ في غضون 10 دقائق. قم بإعطاء المسكنات بعد الجراحة وفقا للوائح رعاية المؤسسية.
ملاحظة: يمكن تحديد الوقت الموصى به للقتل الرحيم وفقا للغرض من التجربة.