$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. تحضير محاليل الهيموجلوبين والسائل الدماغي النخاعي
- قم بإعداد محلول سائل دماغي نخاعي اصطناعي معقم (aCSF) عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول السائل النخاعي الدماغي الدماغي إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل وتخزينه على الثلج.
- قم بإعداد محلول هيموجلوبين معقم 150 مجم / مل عن طريق إضافة 75 مجم من الهيموجلوبين إلى 500 ميكرولتر من aCSF في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل وتخزينه على الثلج.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. تحضير للحقن
- أدر وسادة التسخين إلى الإعداد المتوسط للحفاظ على درجة حرارة جسم الفئران.
- تخدير الفئران بعد الولادة 4 (P4) في غرفة تحريض مملوءة بنسبة 3٪ isoflurane.
ملاحظه: تأكد من التخدير الكافي باستخدام استجابة إصبع القدم / الذيل كل 15 دقيقة. مراقبة التخدير من خلال الملاحظة البصرية للون الأنسجة ودرجة حرارة الجسم ومعدل التنفس.
- يتم تطبيق مسكنات الألم بحقن كاربروفين تحت الجلد 5 ملغ/كغ للفئران المخدرة.
- ضع الجرذ المخدر في الجهاز التجسيمي مع وضع الأنف في محول التخدير بتدفق مستمر بنسبة 1.5٪ من الأيزوفلوران.
- شد قضبان الأذن غير المتمزقة على الصماخ السمعي الخارجي لتأمين الرأس.
ملاحظه: ضع مرهما بيطري للحفاظ على ترطيب العينين إذا كانت العينان مفتوحتين في سن الحقن.
- نظف الرأس بالتناوب مع أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية مبللة بالبيتادين و 70٪ إيثانول.
- المس قضيب البيتادين المنقوع بمنتصف فروة الرأس وافرد البيتادين في دوائر ، وتحرك للخارج.
- كرر الخطوة 2.6.1.1 باستخدام قضيب المنقوع بالإيثانول.
- كرر الخطوة 2.6.1.1 والخطوة 2.6.1.2 3x.
- ضع ستارة جراحية معقمة لحماية المجال الجراحي.
- باستخدام مشرط معقم ، قم بعمل شق 0.3 سم عموديا أسفل منتصف الرأس لفضح بريجما في الجمجمة.
ملاحظه: في حالة الحقن من لامدا ، فقم بكشف لامدا الجمجمة بدلا من البريجما.
- استخدم قضيبا معقما برأس قطني لتجفيف المنطقة.
3. إعداد الحاقن التجسيمي
- اسحب محلول الهيموجلوبين المحضر في الخطوة 1.2 في حقنة معقمة سعة 0.3 مل بإبرة 30G وضع المحقنة في نظام الحاقن التجسيمي.
ملاحظه: في حالة توليد ظروف التحكم ، اسحب محلول aCSF المحضر في الخطوة 1.1 في حقنة معقمة سعة 0.3 مل وتابع البروتوكول.
- قم بتشغيل واجهة الحاقن التجسيمي وانقر فوق الزر "تكوين" لإدخال إعدادات حجم الحقن ومعدله.
- انقر فوق مستوى الصوت واضبط مستوى الصوت على 20,000 nL (20 ميكرولتر).
- انقر فوق معدل التسريب واضبط المعدل على 8,000 نانولتر / دقيقة (8 ميكرولتر / دقيقة).
- اخرج من التكوين بالنقر فوق الزر إعادة تعيين نقاط البيع.
- اغسل طرف الإبرة بالنقر فوق الزر "بنفع" حتى تظهر حبة صغيرة من محلول الهيموجلوبين عند طرف الإبرة.
- قم بفصيل محلول الهيموجلوبين برفق من طرف الإبرة باستخدام قضيب معقم برأس قطني.
< ص الفئة = "jove_title" >
4. حقن
- اضبط بريجما على أنه صفر على نظام الحاقن التجسيمي عن طريق ضبط المواضع المتوسطة والأمامية الخلفية للحقنة قبل خفض طرف إبرة المحقنة المتوهجة للمس الجمجمة برفق عند البرجما.
ملاحظه: في حالة الحقن من لامدا ، اضبط لامدا على أنها صفر.
- تحديد الإحداثيات المختارة.
- في حالة الحقن من بريجما ، في الفئران P4 الموضحة هنا ، استخدم 1.5 مم جانبيا ، و 0.4 مم أماميا ، و 2.0 مم عمقها من بريجما.
- في حالة الحقن من لامدا ، استخدم الإحداثيات التالية لفئران P4: 1.1 مم جانبي ، 4.6 مم أمامي ، و 3.3 مم عمق من لامدا.
- ارفع إبرة المحقنة 1 سم فوق الجمجمة لتنظيف فروة الرأس. عندما يتم رفع المحقنة ، انتقل إلى تعيين الإحداثيات المتوسطة والأمامية الخلفية.
- اخفض إبرة المحقنة للمس الجمجمة برفق. تأكد من أن الإبرة تلامس الجمجمة.
- اضبط الإحداثيات الظهرية البطينية على مدى فترة 30 ثانية.
ملاحظه: أثناء ضبط الإحداثيات الظهرية البطنية ، ستقوم الإبرة بثقب الجمجمة. يجب توخي الحذر للتأكد من أن المحقنة تمر عبر الجمجمة دون تشويه الجمجمة. يتم تجنب تشوه الجمجمة عن طريق سحب الإبرة ببطء على طول الإحداثيات الظهرية البطنية في حالة حدوث تشوه ، ثم إعادة الإبرة على نفس المسار. هذا يسمح للإبرة بالمرور عبر الفتحة الموجودة في الجمجمة بقوة أقل وبدون تشوه.
- على واجهة الحاقن التجسيمي ، انقر فوق الزر "تشغيل" لبدء الحقن.
- بعد الانتهاء من الحقن ، اترك إبرة المحقنة في مكانها لمدة دقيقتين لتقليل التدفق العكسي للمحلول.
- اسحب المحقنة ببطء على طول الإحداثيات الظهرية البطينية على مدى دقيقتين حتى يصل طرف الإبرة إلى 2 سم فوق فروة الرأس.
- قم بتدوير ذراع الحاقن التجسيمي بعيدا عن مجال الجراحة.
< p class = "jove_title" >
5. رعاية ما بعد الجراحة
- أغلق فروة الرأس بخياطة أحادية 6-0. اصنع خياطة واحدة متقطعة بسيطة في وسط الشق 0.3 سم.
- أخرج الجرو من التخدير وضعه في مكان آمن على وسادة التدفئة.
- أعد القوارض إلى قفص المنزل للتعافي من التخدير تحت رعاية سدها.
ملاحظه: تقلل العودة في الوقت المناسب إلى رعاية السد من الوفيات المبكرة بعد الجراحة.
- مراقبة للتخدير عن طريق فقدان المنعكس الصحيح كل ساعة بعد الجراحة لمدة 3 ساعات.
- راقب يوميا لمدة 7 أيام بحثا عن النشاط الطبيعي وتناول الطعام وزيادة الوزن. راقب موقع الشق بحثا عن التئام الجروح وإغلاقه وظهور الفراء مرة أخرى في موقع الجراحة.
ملاحظه: في الحالات النادرة التي لوحظت فيها تغيرات عصبية مثل النوبات أو الاكتئاب المركزي أو انخفاض الشهية أثناء المراقبة ، قم بالقتل الرحيم للحيوان باستخدام التروية داخل الأوعية الدموية أو خلع عنق الرحم تحت التخدير.
- لمنع العدوى بمجرد إغلاق الخيط والتئام الجرح ، ضع مضادا حيويا ثلاثيا موضعيا في موقع الشق.