تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
1. تلطيخ الجسم المضاد الأساسي والسيتين الحيوي
(اليوم 1)
ملاحظة: إجراء التلوين المناعي التالي مخصص للأقسام العائمة بحرية ويتطلب اهزازا مستمرا بسرعة منخفضة (2 دورة / دقيقة ، دورة في الدقيقة) على شاكر لجميع خطوات الحضانة.
- اغسل المنديل 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما في 0.1 M PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4).
ملاحظة: يمكن شراء 0.1 M PBS تجاريا أو تصنيعها في المختبر على النحو التالي (يجعل 1 لتر): 8 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.2 جم من كلوريد الصوديوم ، 1.44 جم من الصوديوم 2 HPO } 4 ، و 0.24 جم من KH2 PO} 4 في 1 لتر من dH}2 O.
ملاحظة: إذا كانت العلامة الكيميائية العصبية المطلوبة معروفة ، فيمكن إجراء تلطيخ البروتين / الببتيد في وقت واحد مع تلطيخ البيويسيتين (الخطوات 1.2 - 1.4) . في حالة تلطيخ البيوسيتين فقط ، انتقل إلى الخطوة 1.5.
- اختياري: كتلة مع مصل حجب 10٪ (BS ؛ مصل الماعز العادي (NGS) مخفف في 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة ساعة واحدة في RT).
ملاحظة: يجب أن يتلقى كل بئر نفس حجم المحلول ؛ الحجم الموصى به يتراوح بين 250 - 500 ميكرولتر / بئر. يعتمد اختيار مصل الحجب على الأنواع التي يتم فيها رفع الأجسام المضادة الثانوية ( على سبيل المثال ، يستخدم NGS في مضاد الماعز المترافق بالصبغة (أنواع الأجسام المضادة الأولية المعنية)). إذا دعت الحاجة إلى استخدام الأجسام المضادة الثانوية التي يتم رفعها في أنواع مختلفة لأقسام البقع المناعية ، قم بتضمين 10٪ من كل مصل طبيعي في الخطوة الحجب (2) و 3٪ من كل مصل طبيعي لخطوات حضانة الأجسام المضادة الأولية والثانوية.
- (اختياري) احتضان الأقسام في الجسم المضاد الأولي ، CB 1 R (متعدد النسيلة ، خنزير غينيا) ، مع 0.3٪ Triton X-100 و 3٪ BS في 0.1 M PBS في RT O / N. CB 1 R يستخدم لتحديد تعبير مستقبلات القنب من النوع 1.
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية وليست مطلوبة للكشف عن حشوة البيوسيتين. يوضح الشكل 2 قسما مسمى biocytin و CB 1 R أثناء عملية التلوين الأولى. حضانة O / N في RT كافية لمعظم الأجسام المضادة الأولية. ومع ذلك ، فإن بعض الأجسام المضادة الأولية ، بما في ذلك CB 1 R ، تتطلب 3 - 5 أيام من الحضانة. إذا كانت الحضانة تحتاج إلى أطول من 1 د ، فمن المستحسن أن تحتضن عند 4 درجات مئوية لأن Triton X-100 يمكن أن يتخلل الشرائح ويمكن أن يؤدي إلى تفكك الأنسجة أثناء الحضانة لفترات طويلة في درجة حرارة الغرفة. قم بتضمين عنصر تحكم سلبي يفتقر إلى جسم مضاد أولي في قسم واحد على الأقل لكل سلسلة من التجارب كعنصر تحكم في خصوصية الجسم المضاد الثانوي. بالنسبة للعناصر الضابطة السلبية ، يتم حذف الجسم المضاد الأساسي ، ولكن تتم إضافة 0.3٪ Triton X-100 في 0.1 M PBS و BS.
(اليوم 2)
- اغسل أقسام الدماغ 3x لمدة 10 دقائق لكل منها في 0.1 M PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4).
- احتضان الأقسام في الصبغة الحمراء الستربتافيدين (التركيز: 1: 1,000 ؛ الإثارة: 594 نانومتر مع انبعاث في الطيف الأحمر المرئي) مع 0.3٪ Triton X-100 و 3٪ BS في 0.1 M PBS عند 4 درجات مئوية O / N في الظلام (ملفوفة بورق الألمنيوم) للكشف عن biocytin. اختياري: قم بتضمين جسم مضاد ثانوي ، خنزير غينيا المضاد للماعز (التركيز: 1: 500 ؛ الإثارة: 488 نانومتر والانبعاث باللون الأخضر) ، مع الحضانة المذكورة أعلاه بعد الحضانة الأولية الاختيارية في الخطوة 1.3.
ملاحظة: لن تكون هناك حاجة إلى جسم مضاد ثانوي إلا إذا تم إجراء تلطيخ الجسم المضاد الأولي الاختياري (الخطوة 1.3). لتصور biocytin ، يوصى باستخدام ستربتافيدين وفلوروفور مترافق مع طيف انبعاث باللون الأحمر ، لأنه يساعد في تصور محاور أدق بالتفصيل وبتباين أفضل ( الأشكال 1 - 3 ).
(اليوم 3)
- اغسل أقسام الدماغ 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في 0.1 M PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4).
- لحماية التألق ولتسهيل إعادة التلوين في المستقبل ، قم بتركيب الأقسام في وسط تثبيت مائي وختم حواف الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
ملاحظة: من الأفضل إعادة طلاء الأقسام في أقرب وقت ممكن لتجنب صعوبات إزالة طلاء الأظافر من الشريحة ، وغزو العفن ، وجفاف الأنسجة بسبب تسرب وسط التثبيت من الشريحة الزجاجية. يمكن منع التلوث الميكروبي باستخدام أزيد الصوديوم 0.02٪ في PBS.
تنبيه: أزيد الصوديوم شديد السمية وقابل للاشتعال عندما يكون ملامسا للماء. يرجى الرجوع إلى إجراءات التشغيل القياسية للتعامل مع المواد الكيميائية الخطرة والتخلص منها.
(الأيام 4 - 7)
- قم بإجراء التصوير متحد البؤر مع الإثارة عند 594 و 488 نانومتر وتكبير 20X أو 40X للكشف عن الخلايا العصبية المملوءة بالسيتين الحيوي في العلامات الحمراء والكيميائية العصبية (CB1 R) باللون الأخضر. تقييم التسمية المشتركة ( الشكل 2 ).
- اضبط تعرض الكاميرا على أقل من 100 مللي ثانية لتجنب التبييض الضوئي والحصول على مكدسات صور متحدة البؤر للعرش المحورية والتغصنية للخلايا العصبية بأكملها. استخدم مجموعات الصور متحد البؤر وحزم برامج تتبع الخلايا العصبية لإعادة بناء مورفولوجيا الخلايا العصبية.
