تلطيخ كيميائي مناعي لبروتين S-100 في أقسام خزعة شفط المستقيم البشري

الملخص

المصدر: Chi, S., Fang, et al. تشخيص مرض هيرشسبرونغ عن طريق خزعات شفط المستقيم المناعية لكالريتينين والبروتين S100 ومنتج جين البروتين 9.5. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو التلوين الكيميائي المناعي لبروتين S-100 في أقسام خزعة شفط المستقيم. يتم حظر الأقسام المسترجعة بالمستضد ومعالجتها بالأجسام المضادة الأولية ، تليها الأجسام المضادة الثانوية ضد S-100 ، وهي علامة على مرض هيرشسبرونج. تضاف الركيزة الكروموجينيك لتلطيخ الخلايا المستهدفة. يتم تجفيف العينات وتركيبها قبل تصورها تحت المجهر.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير أقسام خزعات شفط المستقيم (RSB)

1. ضع خزعات شفط المستقيم في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 6 ساعات لإصلاح الأنسجة. استخدم حجما مثبتا 5 مرات أكثر من حجم الأنسجة.
2. تجفيف الأنسجة باستخدام مجفف الأنسجة المرضية لمدة 11 ساعة. تتكون العملية المبرمجة بأكملها من الخطوات الخمس التالية:
   1. ضع الأنسجة في الفورمالديهايد وقم بإصلاحها لمدة 1 ساعة.
   2. ضع الأنسجة في 75٪ إيثانول لمدة 4 ساعات.
   3. ضع الأنسجة في الإيثانول المطلق (تغييران ، 1 ساعة لكل منهما).
   4. ضع الأنسجة في الإيثانول المطلق (تغييران ، 30 دقيقة لكل منهما).
   5. ضع الأنسجة في الزيلين (ثلاثة تغييرات ، 1 ساعة لكل منهما).
3. ضع الأنسجة في شمع البارافين (58-60 درجة مئوية) (ثلاثة تغييرات ، 1 ساعة لكل منهما). قم بتضمين أنسجة RSB في كتل البارافين.
4. قم بقص كتل البارافين باستخدام ميكروتوم حتى تتعرض الأنسجة بالكامل بمستوى مقطع كامل.
5. قطع الكتل إلى أقسام 0.4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
6. ضع الأقسام في ماء 45-50 درجة مئوية لبضع ثوان لكل منها للسماح للأقسام بالانتشار في طبق مسطح.
7. انقل أقسام البارافين إلى الشرائح.
8. تخبز الشرائح في فرن 60 درجة مئوية لمدة 3-5 ساعات. تجنب الخبز لفترة طويلة ، مما قد يؤدي إلى فقدان المستضدات.
9. ضع الشرائح منزوعة البارافين في الزيلين (تغييران ، 15 دقيقة لكل منهما).
10. رطب الشرائح في الإيثانول المطلق ، 95٪ و 80٪ و 75٪ إيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما. ثم اشطفها بالماء النقي بالتناضح العكسي (RO) لمدة 5 دقائق أخرى.

< p class = "jove_title" >2. استرجاع المستضد

1. قم بعمل تخفيفات عاملة لاسترجاع الكالريتينين عن طريق خلط 4 مل من المخزن المؤقت لاسترجاع مستضد حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) مع 200 مل من الماء النقي بالتناضح العكسي العكسبي. قم بعمل تخفيفات عمل ل S100 ومنتج جين البروتين 9.5 (PGP9.5) استرجاع عن طريق خلط 1 مل من المخزن المؤقت لسترات الصوديوم لحمض الستريك (100x) مع 99 مل من الماء النقي بالتناضح العكسي
   ملاحظة: يمكن استرداد كالريتينين بشكل تفضيلي عن طريق حل استرجاع EDTA. ومع ذلك ، فإن المخزن المؤقت لسترات الصوديوم بحمض الستريك أكثر ملاءمة لاسترجاع S100 و PGP9.5.
2. ضع الشرائح في وعاء تلطيخ كوبلين. املأ البرطمان بمحلول الاسترجاع وضعه في حمام ماء مغلي مسخن مسبقا. بعد الغليان لمدة 20 دقيقة ، أخرج البرطمان من الحمام المائي واتركه يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. تستغرق عملية التبريد حوالي 10 دقائق. قم بإزالة الشرائح واشطفها برفق مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
3. ارسم دائرة بقلم تحديد حول الأنسجة وقم بإعداد صندوق مبلل للإجراءات التالية.

3. الحجب

1. قم بعمل تخفيفات العمل عن طريق خلط 3 مل من 30٪ H₂O₂ مع 27 مل من الماء النقي بالتناضح العكسي العكسوي.
2. قم بإسقاط قطرتين أو ثلاث قطرات من محلول 3٪ H₂O₂ بالتنقيط على الأنسجة لمنع البيروكسيداز. أضف محلول H₂O₂ على الفور للتأكد من أنه لا يفيض من الدائرة. حظر البيروكسيديز في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
3. اشطف الشرائح برفق باستخدام PBS (ثلاث غسلات ، 5 دقائق لكل منها).
4. قم بسد الشرائح لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية باستخدام 5٪ ألبومين مصل بقري (BSA ، محضر عن طريق خلط 1.5 جم من مسحوق BSA مع 30 مل من الماء النقي بالتناضح العكسوي).
   ملاحظة: يمكن أن يمنع الحجب ببيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ 95٪ من التلطيخ غير المحدد ويمكن أن يمنع الحجب باستخدام 5٪ BSA 5٪ من البقع غير المحددة. اجمع بين الطريقتين للحصول على نتيجة موثوقة.

< p class = "jove_title" >4. تفاعل المستضد والأجسام المضادة

1. قم بإزالة BSA بنسبة 5٪ وأضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي (كالريتينين أو S100 أو PGP9.5) إلى الشريحة. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
2. اغسل الشريحة باستخدام PBS (ثلاث مرات ، 3 دقائق لكل منها).
3. أضف 50 ميكرولتر من محسن البوليمر (الكاشف أ ؛ انظر جدول المواد) إلى القسم واحتضنه لمدة 20 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية. ثم اغسل الشريحة باستخدام PBS (ثلاث مرات ، 3 دقائق لكل منهما).
4. أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي B (الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرانب / الفأر) إلى القسم واحتضنه لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية. اغسل القسم ب PBS (ثلاث مرات ، 5 دقائق لكل منهما).

فئة < ص = "jove_title" >5. 3،3-ديامينوبينزيدين وتلوين الهيماتوكسيلين

1. أضف 850 ميكرولتر من الماء المنقى بالتناضح العكسي إلى أنبوب سعة 1.5 مل وأضف كواشف التلوين (انظر جدول المواد) بالترتيب A و B و C. أضف 50 ميكرولتر من كل كاشف للحصول على إجمالي 1 مل من محلول العمل 3،3-diaminobenzidine (DAB). إذا كانت هناك رواسب ، فاستخدم المحلول بعد الترشيح.
2. أضف قطرة من محلول عمل DAB إلى قسم المناديل وصمة عار لمدة 3-10 دقائق. احتضن الشرائح في DAB في درجة حرارة الغرفة حتى يتم اكتشاف تلطيخ بني. راقب بعناية باستخدام مجهر المجال الساطع. حافظ على حل عمل DAB بعيدا عن الضوء. ثم اغسل الشريحة باستخدام PBS لمدة 5 دقائق.
3. أضف قطرة من الهيماتوكسيلين لمواجهة تلطيخ النوى لمدة 1 دقيقة تقريبا. بعد ذلك ، أمسك جرة الكوبلن واغسلها تحت قطرات من الماء لمدة 30-40 ثانية تقريبا حتى تتم إزالة الصبغة الزائدة. احرص على عدم إتلاف أقسام الأنسجة.
4. اغمر شرائح RSB في وعاء كوبلين يحتوي على PBS لمدة 25-30 ثانية. ثم ، تفريق في 1٪ حمض الهيدروكلوريك والإيثانول لمدة 10 ثوان. اغسل الشرائح باستخدام PBS لمدة 1 دقيقة.
5. جفف الشرائح بترتيب عكسي للترطيب: 75٪ ، 80٪ ، 95٪ ، والإيثانول المطلق (5 دقائق لكل منهما).
6. قم بتعريض الشرائح للزيلين (تغييران ، 5 دقائق لكل منهما).
7. قم بتركيب الغطاء باستخدام تركيب فائق النظافة. اترك الشرائح تجف قبل التصور باستخدام المجهر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الجسم المضاد كالريتينين	MXB Biotechnologies	MAB-0716 170416405c	الجسم المضاد: الجسم المضاد الأساسي
الجسم المضاد S-100	MXB Biotechnologies	كيت-0007	الجسم المضاد: الجسم المضاد الأساسي
الجسم المضاد PGP9.5	شنغهاي الأجسام المضادة لونغ آيلاند المحدودة	R-0457-03	الجسم المضاد: الجسم المضاد الأساسي
كاشف المحسن	MXB Biotechnologies	KIT-9902-A 170416405a	الجسم المضاد: الجسم المضاد الثانوي A
الماعز المضاد للأرانب / الفأر IgG المضاد الثانوي	MXB Biotechnologies	كيت آي تي 9902 ب	الجسم المضاد: الجسم المضاد الثانوي B
مجموعة تلطيخ DAB (تحتوي على الكاشف A و B و C)	MXB Biotechnologies	DAB-0031	طقم تلطيخ
حاضنة حرارة	شنغهاي yiheng أداة المحدودة	DHP-9082	أداة
نظام خزعة المستقيم بالشفط Rbi2	Aus Systems Pty Ltd, جنوب أستراليا, أستراليا	CP1200 HP1000 SS1000	أداة
ميكروتوم	لايكا	leica RM2016	أداة
حامض الستريك سترات الصوديوم عازلة (100X)	MXB Biotechnologies	MVS-0101	Antigen Retrieval Buffer
مجفف الأنسجة المرضية	ووهان جونجي الالكترونية المحدودة	JT-12F	أداة