توليد أحداث Ictal العفوية وعند الطلب في الشرائح القشرية لدماغ الفأر

الملخص

المصدر: Chang، M. et al. توليد وبدء نشاط Ictal الحاد عند الطلب في القوارض والأنسجة البشرية. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو تحريض أحداث ictal في الشرائح القشرية الإكليلية من فأر معدل وراثيا يعبر عن القنوات الكاتيونية التي يتم تنشيطها بالضوء في الخلايا العصبية الهرمية القشرية المثيرة. يتم وضع الشريحة في غرفة التسجيل ، ويتم إدخال قطب تسجيل في الطبقة القشرية السطحية. عند التروية بدواء مسبب للنوبات يسد قنوات البوتاسيوم ، تصبح الخلايا العصبية مفرطة الإثارة وتولد أحداثا تلقائية. لتوليد أحداث ictal عند الطلب ، يتم استخدام نبضة ضوئية قصيرة لتنشيط القنوات الكاتيونية في الخلايا العصبية الهرمية ، مما يؤدي إلى إطلاق الناقلات العصبية المثيرة ، والتي تحفز الخلايا العصبية بعد المشبكي على توليد أحداث ictal لفترة قصيرة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. تحضير محاليل التشريح والسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي

1. ماء كربوجينيات عالي النقاء (وهو ماء مفلتر بمقاومة 18.2 MΩ · سم) مع كربوجين (95٪ O₂/5٪ CO₂) لمدة 5 دقائق باستخدام ناشرات فقاعات حجر الهواء (مهويات لأحواض السمك).
   ملاحظه: يمكن توصيل أحجار الهواء بمنظم خزان الكربوجين عبر أنابيب سيليكون قياسية. إذا لم تكن أحجار الهواء متوفرة ، فقم بإغلاق نهاية أنبوب السيليكون وقم بعمل ثقوب صغيرة في الختم للسماح لغاز الكربوجين بالخروج وكربوجين المحلول.
2. قم بإعداد محلول تشريح عن طريق إذابة المواد المذابة من الجدول 1 في ماء عالي النقاء. أضف CaCl₂ إلى محلول تم كربوغناه لمدة 5 دقائق على الأقل لمساعدته على الذوبان.
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، أضف CaCl₂ أولا ، بحيث يمكن أن يذوب بسهولة في محلول غير مشبع. يجب أن يكون المحلول ، في شكل سائل ، 300-320 mOsm / L وأن يكون الرقم الهيدروجيني 7.4 بعد تشبعه بالكربوجين.
   1. قم بتبريد محلول التشريح إلى 0-4 درجة مئوية. اترك المحلول في الثلاجة طوال الليل أو ضع المحلول في الفريزر لمدة 1 ساعة وراقب درجة الحرارة باستمرار.
      ملاحظه: يمكن تخزين محلول التشريح لمدة تصل إلى 3 ليال ؛ تجاهل بعد ذلك.
   2. كربوجين محلول التشريح لمدة 5 - 10 دقائق قبل الاستخدام.
      ملاحظه: من الناحية المثالية ، يجب أن يظهر المحلول إما على شكل طين أو ينتقل إلى طين قبل الاستخدام.
3. تحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي للقوارض (ACSF) عن طريق إذابة المواد المذابة من الجدول 2 في ماء فائق النقاء. كربوجين محلول ACSF أثناء وجوده في حمام مائي ساخن إلى 35 درجة مئوية حتى الاستخدام. أضف CaCl₂ إلى محلول تم كربوغناه لمدة 5 دقائق على الأقل لمساعدته على الذوبان.
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، أضف CaCl₂ أولا حتى يذوب بسهولة في محلول غير مشبع. يجب أن يكون المحلول ، في شكل سائل ، 290-320 مللي أسمول / لتر وأن يكون الرقم الهيدروجيني 7.4 بعد تشبعه بالكربوجين. يجب إجراء الحلول بأحجام 1 أو 2 أو 4 لتر حسب مدة التجارب. اصنع 4 لتر ليوم كامل (8 ساعات) من التجارب. يجب أن يكون ACSF طازجا كل يوم ؛ لا تقم بتخزينه لمدة تزيد عن 1 يوم.

< p class = "jove_title" >2. تشريح الفأر لجمع أنسجة المخ

1. اجمع جميع الأدوات والمواد اللازمة لتشريح. قم بإعداد مساحة العمل للتحضير لتشريح.
   1. افحص خزان الكربوجين (95٪ O₂/5٪ CO₂) للتأكد من أنه ليس فارغا. استبدل أسطوانة الغاز قبل التجارب إذا كان هناك أقل من 500 رطل لكل بوصة مربعة من الضغط.
   قم
   2. بمعايرة الاهتزاز (قطاعة الأنسجة ذات الشفرة الاهتزازية) وفقا لدليل تعليمات الشركة المصنعة. اضبط إعداد الاهتزاز بحيث يكون سعة القطع 1 مم وسرعة قطع 0.12 مم / ثانية
      ملاحظه: قد تختلف الإعدادات المثلى لكل قاطع شفرة مناديل اهتزازي فردي ؛ ومع ذلك ، بشكل عام ، يجب أن تكون السعة عالية ويجب أن تكون سرعة القطع منخفضة.
   3. املأ غرفة حضانة شريحة الدماغ (أي حافظ شريحة الدماغ) ب ACSF وقم بفقاعاتها بالكربوجين. ثم ضع حجرة الحضانة في حمام مائي على درجة حرارة 35 درجة مئوية.
2. الحصول على فأر حدث من الجنسين، يتراوح عمره بين 13 د (ص 13) و 21 د (ص 21، حيث يكون p0 هو تاريخ الميلاد).
3. تخدير الفأر بحقن بينتوباربيتال الصوديوم داخل الصفاق (55 ملغ/كغ من وزن الجسم). بمجرد تخدير الماوس بعمق ، كما يتضح من عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم ، استخدم على الفور أداة مقصلة معتمدة من الطبيب البيطري لقطع رأس الماوس بحركة واحدة سريعة.
   ملاحظه: تحضير حقن البنتوباربيتال الصوديوم وفقا للإجراءات الموصى بها في الإرشادات المؤسسية.
4. أمسك أنف الفأر لتثبيت الرأس المقطوع وقم بعمل شق خط الوسط برفق بدءا من عيني الفأر وعلى طول فروة الرأس بالكامل لكشف الجمجمة. تأكد من عدم ضغط الجمجمة بالضغط الذي تمارسه ماكينة الحلاقة. استخدم زاوية حافة ماكينة الحلاقة لزيادة دقة القطع.
5. انشر اللوحات من فروة رأس الفأر باستخدام الأصابع لكشف الجمجمة. بعد ذلك ، استخدم الزاوية الجديدة لحافة الحلاقة لعمل شق على طول خط الوسط للجمجمة. انتبه جيدا لتجنب أي اتصال مع القشرة الدماغية.
6. أدخل ملقط منظيا في تجاويف عين الماوس لتثبيت الرأس المقطوع وضعه في طبق بتري مملوء بمحلول تشريح بارد (0-4 درجة مئوية). تأكد من أن الرأس مغمور بالكامل في محلول التشريح.
7. استخدم مجموعة ثانية من الملقط المشظية لتقشير فروة رأس الفأر برفق ، وإزالة عظم الأنف عن طريق تقشيره ، وإزالة الجزء الخلفي (الجانب الذيلي) من الجمجمة.
   ملاحظه: عظم أنف الفئران الصغيرة ناعم جدا ويمكن كسره بسهولة.
8. استخدم ملعقة دقيقة لقطع الأعصاب البصرية والأعصاب ثلاثية التوائم والحبل الشوكي. بعد ذلك ، استخدم الملعقة الدقيقة لفصل الدماغ برفق عن الجمجمة. اترك الدماغ مغمورا بالكامل في طبق بتري المليء بمحلول التشريح.

< ص الفئة = "jove_title" >3. تحضير الشرائح القشرية من القشرة الحركية الحسية الجسدية

1. املأ صينية الاهتزاز العازلة ب ~ 150 مل من محلول التشريح البارد (0 - 4 °C).
   ملاحظه: اختياريا ، احتفظ بالصينية العازلة في الفريزر لحين الحاجة للحفاظ على درجة حرارة منخفضة أثناء إجراء التقطيع.
قم
2. بلصق أنسجة المخ من الماوس على مرحلة الاهتزاز (حامل العينة / الصينية) باستخدام غراء لاصق فوري. بالنسبة للفئران ، قم بقطع جزء ذيلي صغير من الدماغ (أي المخيخ) بحيث يمكن لصقه بسهولة بشكل مسطح على حامل العينة (مما يسمح للجانب المنقاري من الدماغ بمواجهة السقف).
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن تحضير شرائح دماغ الفأر الأفقية عن طريق لصق الجانب الظهري من الدماغ على حامل العينة (يجب أن يواجه الجانب البطني من الدماغ السقف).
3. ضع حامل العينة برفق (مع أنسجة الدماغ) في الدرج العازلة. تأكد من أن الجزء الظهري من الدماغ يواجه شفرة الاهتزاز.
   ملاحظه: من الأهمية بمكان تقليل مقدار الوقت الذي يتعرض فيه الدماغ للهواء.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تقسيم أنسجة المخ وجمعها

1. قم بتقطيع الدماغ إلى شرائح بسمك 450 ميكرومتر باستخدام الاهتزاز في الاتجاه الظهري إلى البطني. تأكد من أن الدماغ يظل مثبتا تماما في صينية العينات أثناء تقطيعها.
   1. قم بعمل أول قطع في دماغ الفأر لإزالة البصلة الشمية. بعد ذلك ، قم بإجراء تخفيضات لاحقة حتى يتم ملاحظة المنطقة الحركية الحسية الجسدية (تقع في منتصف الطريق تقريبا بين البصلة الشمية والبريجما).
      ملاحظه: اختياريا ، قم بتقطيع الدماغ إلى شرائح أرق (200 ميكرومتر) حتى يظهر الجسم الثفني في المنظر الإكليلي للدماغ ، مما يشير إلى أن المنطقة الحسية الجسدية الحركية قريبة.
2. استخدم ماصة نقل واسعة التجويف لتجميع الشرائح الإكليلية (450 ميكرومتر) التي تحتوي على المنطقة الحسية الجسدية الحركية وغمرها في طبق بتري يحتوي على محلول تشريح بارد (0-4 درجات مئوية).
3. استخدم شفرة حلاقة جديدة واقطع أي أنسجة زائدة من الشرائح. بالنسبة للشرائح الإكليلية من الفئران ، قم بإجراء قطع عرضي أسفل القشرة القشرية الحديثة مباشرة (أي الجسم الثفني). لا تقطع في حركة النشر. ما عليك سوى الضغط على الشفرة في الأنسجة واستخدام فرشاة تفصيلية لفصل الأنسجة برفق. تأكد من تقليل حركة الشريحة الإكليلية.
4. استخدم ماصة نقل واسعة التجويف لنقل الجزء الظهري من الشرائح الإكليلية التي تحتوي على القشرة المخية الحديثة (الطبقة 1 - 6) إلى طبق بتري ثان مملوء ب ACSF الدافئ (35 درجة مئوية) للحظة (~ 1 ثانية). بعد ذلك ، انقل الشرائح على الفور إلى غرفة حضانة تحتوي على ACSF المكربونى الدافئ (35 درجة مئوية)
   ملاحظه: الغرض من النقل إلى طبق بتري باستخدام ACSF هو تقليل نقل محلول التشريح إلى غرفة الحضانة أثناء نقل شرائح الدماغ باستخدام الماصة ذات التجويف العريض. استخدم الآبار المتعددة لغرفة الحضانة للحفاظ على شرائح الدماغ المختلفة منظمة.
5. تخلص من باقي الدماغ وجثة وفقا للإرشادات المؤسسية.

< p class = "jove_title" >5. الحضانة والصيانة

1. اترك شرائح الدماغ مغمورة قليلا في غرفة الحضانة عند 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بإزالة حجرة الحضانة من الحمام المائي واتركها تعود إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية). انتظر 1 ساعة حتى تتعافى شرائح الدماغ قبل إجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية.
   ملاحظه: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء تتجمع تحت شرائح الدماغ في غرفة الحضانة. فقاعات الهواء هي واجهات هوائية تسبب تلف الأنسجة. يمكن الحفاظ على شرائح دماغ الفأر لمدة 6-8 ساعات في غرفة حضانة جيدة الكربوجين مع ACSF.

< p class = "jove_title" >6. التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية للطبقة القشرية السطحية

ملاحظة: لوحظت أحداث Ictal في تسجيلات إمكانات المجال المحلي خارج الخلية (LFP) من شرائح الدماغ. يمكن ملاحظة LFP لشريحة الدماغ وتسجيلها إما باستخدام غرفة من نوع الواجهة أو نظام مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية المغمورة (MEA).

1. استخدم ماصة نقل واسعة التجويف أو فرشاة تفصيلية لتحريك شريحة من الدماغ على ورق عدسة مقطوع مسبقا أكبر قليلا يتم تثبيته في مكانه باستخدام ملقط الأسنان. انقل ورق العدسة (الذي تستقر عليه شريحة الدماغ) إلى غرفة التسجيل وثبته في موضعه باستخدام شاشة القيثارة.
2. قم بتشغيل دافئ (35 درجة مئوية) ، ACSF المكربن من خلال غرفة التسجيل فوق شريحة الدماغ بمعدل 3 مل / دقيقة (~ 1 بالتنقيط / ثانية). استخدم مقياس حرارة رقمي للتأكد من أن غرفة التسجيل هي 33 - 36 درجة مئوية.
3. اسحب أقطاب كهربائية زجاجية بمقاومة 1-3 MΩ من أنابيب زجاج البورسليكات (بقطر خارجي 1.5 مم) باستخدام مجتذب. قم بإعادة ملء الأقطاب الكهربائية الزجاجية باستخدام ACSF (~ 10 ميكرولتر) باستخدام حقنة هاميلتون. تخلص من القطب الكهربائي على الفور في حالة تلف الطرف.
   ملاحظه: قم بتبييض السلك الفضي (5 دقائق) واسمح فقط بغمر جزء صغير (أي طرف) من السلك الفضي في الأقطاب الكهربائية الزجاجية المملوءة بالخلف ACSF لتقليل الضوضاء والانجراف أثناء التسجيلات. قم بإزالة أي ACSF زائد من القطب الزجاجي باستخدام حقنة هاميلتون إذا لزم الأمر.
4. استخدم مجهر استريو 20X لتوجيه قطب زجاج التسجيل بدقة إلى الطبقة القشرية السطحية (2/3) باستخدام معالجات يدوية. تسجيل / عرض النشاط الكهربائي لشريحة الدماغ على جهاز كمبيوتر باستخدام برنامج قياسي.
   ملاحظه: ستظهر شرائح الدماغ القابلة للحياة (عالية الجودة) إمكانات قوية مستحثة استجابة للمنبهات الكهربائية المطبقة (100 ميكرو ثانية ، 30-300 ميكرو أمبير) أو النبضات الضوئية (30 مللي ثانية ، 10 ميغاواط / مم²) للأنسجة البصرية.

< p class = "jove_title" >7. تحريض الأنشطة الشبيهة بالنوبات

1. Perfuse ACSF الذي يحتوي على 100 ميكرومتر 4-أمينوبيريميدين (4-AP) فوق شريحة الدماغ. قم بإذابة 80 مجم من 4-AP في 8.5 مل من الماء لعمل محلول مخزون 100 ملي مولار 4-AP. أضف 100 ميكرولتر من محلول مخزون 100 ملي مولار 4-AP إلى 100 مل من ACSF لتحقيق انحياء ACSF مع 100 ميكرومتر 4-AP.
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، استخدم Zero-Mg^{2 +} ACSF (الجدول 3) ، وهو محلول ACSF معدل لا يحتوي على Mg²⁺ مضاف ، لنشر شريحة الدماغ. متوسط الوقت لظهور أحداث ictal هو 15 دقيقة. ومع ذلك ، قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 40 دقيقة لبعض شرائح الدماغ.

< p class = "jove_title">8. توليد النوبات عند الطلب: استراتيجية بصرية وراثية للفئران البصرية الوراثية

1. قم بتطبيق نبضة قصيرة (30 مللي ثانية) من الضوء الأزرق (470 نانومتر) (بحد أدنى 1 ميجاوات / مم² شدة إخراج) لبدء حدث ictal. استخدم مناور يدويا لوضع ألياف ضوئية بقطر 1,000 ميكرومتر (0.39 أمبير أميرك) فوق منطقة التسجيل مباشرة.
   ملاحظه: اضبط معدل التحفيز الضوئي ليتناسب مع المعدل المطلوب لحدوث حدث ictal (أي نبضة واحدة كل 50 ثانية). ومع ذلك ، لا يمكن المبالغة في المعدل من المعدل الجوهري الذي تحدث به أحداث ictal.

الجدول 1: وصفة لحل التشريح.هذه تعليمات لعمل أحجام 1 لتر أو 2 لتر. ميغاواط = الوزن الجزيئي للمذاب.

# الكاشف Conc. [م] ميغاواط (جم / مول) 1 لتر (جم) 2 لتر (غ) 1 سكروز 248 342.3 [إ] 84.89 دولار 169.78 دولار 2 بيكربونات الصوديوم (NaHCO₂) 26 84.01 دولار 2.18 [إ] 4.37 [إك] 3 سكر العنب (د-جلوكوز) 10 180.16 1.8 ب 3.6 [إ] 4 كلوريد البوتاسيوم (KCl) 2 74.55 دولار 0.15 دولار 0.3 5 كبريتات المغنيسيوم (MgSO₄ · 7 ساعات₂درجة) 3 246.47 دولار 0.74 دولار 1.48 دولار 6 أحادي هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (H₂NaPO₄ · H₂O) 1.25 137.99 0.17 دولار 0.34 7 كلوريد الكالسيوم (كلوريد_{الكالسيوم 2} · 2 ساعة₂درجة مئوية) 1 147.01 دولار 0.15 دولار 0.29 < p class = "jove_content" >الجدول 2: وصفة للسائل الشوكي الدماغي الاصطناعي للقوارض (ACSF).هذه تعليمات لعمل أحجام 2 لتر أو 4 لتر. ميغاواط = الوزن الجزيئي للمذاب.

# الكاشف Conc. [م] ميغاواط (جم / مول) 2 لتر (غ) 4 لتر (جم) 1 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) 123 58.4 دولار 14.37 دولار 28.73 دولار 2 بيكربونات الصوديوم (NaHCO₂) 26 84.01 دولار 4.37 [إك] 8.74 دولار 3 سكر العنب (د-جلوكوز) 10 180.16 3.6 [إ] 7.21 [إ] 4 كلوريد البوتاسيوم (KCl) 4 74.55 دولار 0.6 1.19 5 كبريتات المغنيسيوم (MgSO₄ · H₂O) 1.3 246.47 دولار 0.64 1.28 6 أحادي هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (HNaPO₄ · H₂O) 1.2 137.99 0.33 دولار 0.66 7 كلوريد الكالسيوم (كلوريد_{الكالسيوم 2} · 2 ساعة₂درجة مئوية) 1.5 147.01 دولار 0.44 0.88 < ص الفئة = "jove_content" >الجدول 3: وصفة للسائل الشوكي الدماغي الاصطناعي صفر المجم²⁺ القوارض (صفر ملغ^{2 +} ACSF).هذه تعليمات لعمل أحجام 2 لتر أو 4 لتر. ميغاواط = الوزن الجزيئي للمذاب.

# الكاشف Conc. [م] ميغاواط (جم / مول) 2 لتر (غ) 4 لتر (جم) 1 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) 123 58.4 دولار 14.37 دولار 28.73 دولار 2 بيكربونات الصوديوم (NaHCO₂) 26 84.01 دولار 4.37 [إك] 8.74 دولار 3 سكر العنب (د-جلوكوز) 10 180.16 3.6 [إ] 7.21 [إ] 4 كلوريد البوتاسيوم (KCl) 4 74.55 دولار 0.6 1.19 5 كبريتات المغنيسيوم (MgSO₄ · H₂O) حر اسميا 246.47 دولار 0 0 6 أحادي هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (HNaPO₄ · H₂O) 1.2 137.99 0.33 دولار 0.66 7 كلوريد الكالسيوم (كلوريد_{الكالسيوم 2} · 2 ساعة₂درجة مئوية) 1.5 147.01 دولار 0.29 0.59

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بنتوباربيتال الصوديوم	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال موردي مستشفى تورنتو الغربي
حقنة 1 مم	غير متوفر	غير متوفر	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
25G 5/8 "إبرة معقمة	غير متوفر	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
شفرة حلاقة أحادية الحافة (2x)	غير متاح	غير متوفر	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
غراء لاصق فوري	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
ورق العدسة	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
صحن بتري زجاجي (2x)	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
ملقط منشق (2x)	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
ملعقة صغيرة بمقبض PVC	غير متاح	N/A	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
ملعقة صغيرة بنهاية مسطحة	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
فرشاة التفصيل 5/0	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من متجر فني بوتيك
ماصة نقل التجويف العريض	غير متاح	غير متوفر	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
ملاقط الأسنان	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
ميزان حرارة (رقمي)	غير متوفر	غير متاح	تم شراؤها على Amazon.ca
فحص خزان الكربوجين (95٪O2/5٪CO2)	غير متوفر	غير متاح	تم شراؤها من خلال موردي مستشفى تورنتو الغربي
Vibratome	لايكا	غير متاح	تم شراؤها من خلال موردي مستشفى تورنتو الغربي
غرفة حضانة شريحة الدماغ (المعروفة أيضا باسم حارس شريحة الدماغ)	شركة تصميم الأنظمة العلمية	غير متاح
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)	غير متاح	غير متوفر	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
بيكربونات الصوديوم	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
سكر العنب	غير متوفر	N/A	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4. H2O)	غير متاح	غير متوفر	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
أحادي هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (HNaPO}4·H2O)	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
كلوريد الكالسيوم (CaCl2·2H2O)	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med
السكروز	غير متاح	غير متاح	تم شراؤها من خلال متجر UT Med