إحداث نقص التروية عن طريق انسداد الشريان السباتي الدماغي الأوسط والشريان السباتي المشترك في نموذج الفئران

الملخص

المصدر: Wayman، C. et al.، {{}} إجراء الدماغ الأوسط البعيد الدائم مع انسداد الشريان السباتي المشترك في الفئران المسنة لدراسة نقص التروية القشرية مع إعاقة مستمرة. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو إجراء إجراء انسداد الشريان الدماغي الأوسط البعيد الدائم ، أو MCAO ، مع الشريان السباتي المشترك ، أو ربط CCA ، في الفئران المسنة لنمذجة السكتة الدماغية الإقفارية. هذا يمنع تدفق الدم إلى الدماغ ، مما يؤدي إلى موت الخلايا العصبية وإنشاء نموذج لدراسة آليات السكتة الدماغية والعلاجات المحتملة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الجراحة

1. استخدم إناث الفئران المسنة ذات القلنسوة Lister في سن 16-18 شهرا (250 إلى 400 جم) وقم بتحفيز التخدير بنسبة 5٪ من الأيزوفلوران في 1.5 لتر / دقيقة O _{} 2} . بعد تحريض التخدير ، قم بتقليل مستوى الأيزوفلوران والحفاظ عليه عند عمق مناسب ولكن أقل للجراحة ( على سبيل المثال ، 1.5-2٪). قم بتوصيل التخدير للحيوان بواسطة قناع الوجه ، واستخدم نظام الكسح للحد من تعرض الجراح للأيزوفلوران.
   1. قم بتنفيذ جميع الإجراءات حتى ، ولكن ليس بما في ذلك بضع القحف على الوهمية ، لأن هذا الإجراء يمكن أن ينتج عجزا سلوكيا. ضع في اعتبارك الأهداف التجريبية عند تصميم تجارب انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) ، وقرر ما إذا كان يجب تضمين مجموعة زائفة للتحكم في حج القحف أم لا.
2. يجب تطبيق مسكنات الألم قبل الجراحة أو ما قبلها (Carprieve، 0.25 ملغ/كغ، قطع).
   1. أضف 1 مل إلى 19 مل من محلول ملحي معقم 0.9٪ لعمل محلول المرق وحقن 0.6 مل لكل 300 جرام من الفئران. يفضل استخدام Carprieve على Carprofen لأن الأول مستقر في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. احلق الفراء في منطقة الرقبة البطنية والمنطقة الصدغية في نصف الكرة الأيمن لكشف الجلد. تطهير المواقع الجراحية باستخدام مسحات الإيثانول.
   1. قم بتنفيذ هذه الخطوة بعيدا عن منطقة التشغيل لتقليل كمية الفراء في موقع الشق.
4. ضع الجرذ على لوح من الفلين مغطى بستارة معقمة في وضع ضعيف على وسادة تدفئة. ضعي كريم الليدوكائين على المناطق المحلوقة من الرأس والرقبة. أدخل مسبارا مستقيميا لمراقبة درجة حرارة والحفاظ عليها بين 36.5-37.5 درجة مئوية باستخدام نظام حرارة منزلية.
   1. ضعي مرهم الدمع على العينين لمنع الجفاف. أعط الجرذ حقنة محلول كبريتات الأتروبين (0.05 مل من محلول 600 ميكروغرام / مل ، تحت الجلد) لتقليل إفرازات القصبة الهوائية.
      ملاحظة: يجب على الباحثين التفكير في قياس المتغيرات الفسيولوجية مثل غازات الدم والضغط.
5. قبل بدء الجراحة ، تحقق من سحب قرصة المخلب الخلفي وردود أفعال الوميض لتأكيد التخدير الكامل.
6. تحت مجهر تشريح ، قم بعمل شق خط الوسط المركزي بطول 2 سم على الرقبة المكشوفة باستخدام مشرط. حرك الغدد اللعابية برفق إلى القصبة الهوائية على كلا الجانبين.
7. قم بلف خياطة حريرية غير قابلة للامتصاص حول الجلد الذي يغطي الشريان السباتي المشترك على جانب واحد. اسحب الجلد برفق من الموقع باستخدام خياطة الحرير وألصقها على اللوح باستخدام شريط جراحي للكشف عن الشريان السباتي المشترك. قم بتشريح الشرايين بعناية الخالية من اللفافة المحيطة والأعصاب المبهمة باستخدام ملقط دقيق.
   1. احرص على عدم تلف العضلات أو الأعصاب المبهمة أثناء هذه الخطوة ، لأن ذلك سيضعف التغذية والبلع والتنفس.
8. بمجرد أن ينكشف الشريان السباتي المشترك ، استخدم خياطة حريرية غير قابلة للامتصاص (5/0) لعزل الشريان السباتي ، أولا فصل الشريان السباتي عن العصب المبهم عن طريق التشريح العكسي بالملقط الدقيق والحرص على عدم ملامسة العصب. بمجرد أن يتم لف الوعاء (ولكن لم يتم ربطه) بالخياطة ، قم بلصق طرفي الخيط معا باستخدام شريط جراحي لمنع التراجع عن هذه الخطوة. قم بإزالة الغرز التي تمنع الجلد المغطى.
9. كرر للجانب الآخر.
10. ضع شاشا معقما مبللا بالمحلول الملحي في الجرح للحفاظ على رطوبة الأنسجة خلال الفترة المتبقية من الجراحة. خياطة الجلد بشكل غير محكم وضع شاش إضافي مبلل بالمحلول الملحي على المنطقة لمنع المزيد من الجفاف.
11. ضع الفئران في وضع جانبي وقم بعمل شق في الجلد عند نقطة المنتصف بين المدار الأيمن والقناة السمعية الخارجية. اسحب الجلد باستخدام ما يصل إلى خمسة مباعدات خطاف مرنة مقاس 3 مم مثبتة على اللوح ثم قم بتشريح العضلة الصدغية بشكل حاد للكشف عن الجمجمة.
12. ضع تنقيطا ملحيا مدفوعا بالجاذبية معدلة بعجلة الإبهام فوق الموقع المفتوح (معدل التدفق حوالي 2 مل / دقيقة) وقم بإعداد نظام شفاط لإزالة بقايا العظام وإزالة النزيف الطفيف من الموقع المكشوف طوال هذه المرحلة من الجراحة.
    1. ضع فوهة توصيل المحلول الملحي في أعلى نقطة في الجمجمة بالقرب من الأذن ، وضعي فوهة الشفاط في أدنى نقطة. اضبط العجلة أثناء النزيف لتزويد المنطقة بمزيد من الملوحة لتصور مصدر أي نزيف لكي الوعاء بشكل أفضل ، مما يقلل من مقدار الوقت الذي تكون فيه تحت التخدير.
13. قم بإجراء بضع القحف على المنطقة المكشوفة (حوالي 5 مم × 5 مم) باستخدام مثقاب أسنان مع لدغ حفر خشن مطلي بالماس مقاس 1.6 مم عند حوالي 8,000 دورة في الدقيقة ، مما يضمن تطبيق الضغط الدائري والجانبي وليس الضغط الهبوطي أثناء حفر المنطقة المكشوفة. بمجرد أن يصبح العظم رقيقا بدرجة كافية بحيث يبدو شفافا تماما ، قم بإزالته باستخدام الملقط.
14. استخدم خطافا جافيا محليا الصنع ، مصنوعا عن طريق ثني طرف واحد من الملقط الناعم حوالي 180 درجة لتشكيل قوس ، لفتح الجافية بعناية ، مع توخي الحذر لتجنب الأوعية الدموية السطحية الكبيرة ، لأنها حساسة وسهلة التمزق.
    ملاحظة: ستكشف المنطقة المكشوفة من الدماغ عن الشريان الدماغي الأوسط (MCA). يبلغ طول المقطع المطلوب حوالي 2 مم (انظر الشكل 1 ).
15. تخثر MCA من حيث يعبر الوريد الدماغي السفلي ، إلى نقطة تشعب الشريان ثم على طول الفروع الذيلية ل MCA باستخدام زوج من ملقط الإنفاذ الحراري حتى يتم انسداده بالكامل. استخدم ملقط إنفاذ الصمام الكيميائي بزاوية مع أطراف مدببة 0.25 مم.
    1. عند انسداد الشريان ، قم بتغيير تدفق المحلول الملحي حسب الضرورة للحفاظ على برودة هذه المنطقة ، مما يمنع ملقط التخثر من الالتصاق بالأوعية الدموية. عند انسدادها ، يظهر الوعاء الدموي أسود ويجب ألا تكون هناك علامة على تدفق الدم. يمكن رؤية تدفق الدم في الأوعية المسدودة جزئيا.
    2. قم بقص MCA في هذه المرحلة لتأكيد الانسداد الكامل. باستخدام مقص الأوعية الدموية الدقيقة ، قم بقص أسفل المكان الذي يعبر فيه الوريد الدماغي السفلي MCA.
    3. قم بتغطية المنطقة المكشوفة بقطعة شاش مبللة بالمحلول الملحي قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
16. أعد الجرذ إلى وضع ضعيف وأعد فتح الخيط المربوط بشكل فضفاض على الرقبة لإعادة تعريض الشرايين السباتية. اربط الشريان السباتي على نفس جانب MCA المسدود (على اليمين) بشكل دائم عن طريق ربط عقدة في خياطة الحرير حول الشريان السباتي ، بينما يتم انسداد الشريان السباتي الأيسر بشكل عابر باستخدام مشبك شريان من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 13 مم بضغط 125 جم لمدة 60 دقيقة. قم بخياطة الشق في الرقبة بشكل غير محكم خلال هذا الوقت وضع شاشا معقما مبلل بالمحلول الملحي في الأعلى لمنع الجفاف.
    1. لاحظ أن الجانب الأيمن للحيوان سيكون على الجانب الأيسر للجراح ، بالنظر إلى وضع ضعيف.

النتائج

الشكل 1. الإعداد الجراحي لنموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط البعيد الدائم. يتم عرض المعدات المستخدمة في إعداد بضع قحف الفئران لنصف الكرة الأيمن ، وداخل ، وضع الشفاط ، والتنقيط الملحي حول موقع استئصال الجرافة. تظهر أيضا السمات الرئيسية للأوعية الدموية. يظهر الشريان الدماغي الأوسط (الأحمر) والوريد الدماغي السفلي (الأزرق) ، وتشير المنطقة المظللة إلى مكان حدوث تخثر الشريان. يتم تأكيد الانسداد عن طريق ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كاربروفين	نوربروك	رقم VM؛ 02000/4229	أعط 0.25 مجم / كجم
كبريتات الأتروبين	AmTech	RXATRINJ-100
مسحات الكحول	UHS	20021
كريم الليدوكائين (Emla)	AstraZeneca	12901	ضع قطرة بحجم حبة البازلاء على الرقبة المحلوقة والمناطق الصدغية
نظام بطانية Homeothermic	هارفارد للصناعات	50722F
ملقط	أدوات العلوم الجميلة	11019-12
إيزوفلوران	أبوت	B506
خيوط الحرير	جهاز هارفارد	723288
نظام الكي	Eschmann
0.25 مم ملقط الجر المجوهري	Eschmann	8330349
ملقط دومون الدقيق	أدوات العلوم الجميلة	11251-10
نظام التنقيط الملحي المدفوع بالإبهام
نظام شفاط Vacusafe	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
نتوءات فولاذية مطلية بالماس الخشن مقاس 16 مم		K801 104 016
مثقاب أسنان محمول باليد	NSK	NSKVMAXVRE (قبضة NSKEX6B)
مقص زنبركي فاناس	أدوات العلوم الجميلة	15000-03
مقص الأوعية الدموية الدقيقة	الأجهزة الدقيقة العالمية	501790
4-0 خيوط فيكريل	Ethicon
مشبك الأوعية الدموية وقضيب
مجهر التشغيل	زايس
نظام التخدير المضغوط Isoflurane K / F غاز واحد	حلول VetTech
شفرات مشرط من الصلب الكربوني رقم 10	سوان مورتون	201
25 جرام إبر	Terumo	NN-2525R
محاقن (1 مل و 5 مل)	تيرومو	SS+01T1 / SS*05SE1
محلول ملحي (كلوريد الصوديوم 0.9٪)	فريسينيوس كابي	رر 08828/0178
براعم القطن	جونسون وجونسون	5.00021E+12	التعقيم قبل الاستخدام
شاش			التعقيم قبل الاستخدام