تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير حقنة للحقن
- قم بإذابة الليزولسيثين في محلول ملحي مخزن بالفوسفات بنسبة 1٪ (PBS ؛ درجة الحموضة 7.4) وتخزينه عند -20 درجة مئوية في كميات صغيرة (75 ميكرولتر). قم بإذابة قارورة في درجة حرارة الغرفة (RT).
ملاحظه: إذا كان الليزولسيثين غير مذاب ، فقم بصوتنة الأنبوب في منظف بالموجات فوق الصوتية (40 كيلو هرتز) لمدة 30 دقيقة تقريبا لتشكيل حل موحد.
- تعامل مع الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة مسبقا بحذر شديد لتجنب إتلاف الطرف الرقيق. قم بفك صامولة حقنة حقن سعة 10 ميكرولتر وقم بربطها على الطرف المسطح للشعرية ، متبوعا بحلقتين ، مما يضمن محاذاة طرفي التزاوج للحلقات وأن الشعيرات الدموية دافئة في الطويق المخروطي (الشكل 1). شطف المحقنة مع الكحول الأيزوبروبيل وإزالة المكبس. بمجرد أن يجف ، قم بربط يد تجميع الإبرة بإحكام على حقنة الحقن.
- قم بتوصيل إبرة المحور المعدني بحقنة التحضير. اخترق قرصا مطاطيا بالإبرة وحركه لأسفل إلى القاعدة. املأ حقنة التحضير بالليسوليسيثين. اضغط برفق على حقنة التحضير حتى يظهر السائل عند طرف الإبرة. هذا يضمن عدم إدخال فقاعات الهواء في حقنة الحقن.
- أدخل إبرة المحور المعدنية للحقنة الأولية في حقنة الحقن. قم بعمل ختم ثابت بالقرص المطاطي ، واضغط ببطء على حقنة التحضير حتى تملأ الشعيرات الدموية الطرف بالمحلول. قم بإزالة حقنة التحضير بعناية مع الضغط في نفس الوقت لملء برميل حقنة الحقن دون إدخال فقاعات هواء. أدخل المكبس في حقنة الحقن وتأكد من تدفق المحلول من طرف الشعيرات الدموية حيث يتم ضغط المكبس برفق.
ملاحظه: إذا كانت هناك أي فقاعات هواء مرئية في الحقنة الشعرية أو حقنة الحقن ، فيجب تكرار تحضير المحقنة من البداية. يعد السائل المستمر في جهاز الحقن أمرا بالغ الأهمية لضمان أحجام الحقن الدقيقة.
- قم بتوصيل حقنة الحقن المكتملة بذراع أداة المعالجة الدقيقة التجسيمية. سيكون هذا الجهاز المكتمل قادرا على حقن 15-20 قبل الحاجة إلى إعادة تعبئته.
- تخلص من الليزولسيثين المتبقي من حقنة التحضير. اسحب كحول الأيزوبروبيل وقم بالضغط عليه عدة مرات ، وافصل إبرة المحور المعدني. انتظر عدة ساعات حتى يتبخر كحول الأيزوبروبيل المتبقي في حقنة التحضير قبل ملئه مرة أخرى.
فئة
2. تحضير للإجراء الجراحي
ملاحظة: يتم وصف هذا الإجراء لإناث الفئران C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين 8-10 أسابيع.
- تخدير بحقن داخل الصفاق من الكيتامين (200 مجم / كجم) والزيلازين (10 مجم / كجم) أو وفقا للوائح رعاية المؤسسية. خطط ليكون تحت التخدير لمدة 1 ساعة تقريبا في حالة استخدام التخدير عن طريق الحقن.
- اختبر أن مخدر بعمق عن طريق الضغط بقوة على القدم. لن يستجيب المخدر بشكل صحيح للقرصة.
- باستخدام المقص ، احلق مساحة 2-3 سم2 على الجانب الظهري للحيوان ، بالقرب من الأذنين. احرص على عدم إتلاف الأذنين.
- امسح المنطقة نظيفة باستخدام 70٪ من الإيثانول المطبق على وسادة الشاش. تأكد من إزالة كل الشعر المقطوع من المنطقة. تطهير المنطقة باليود.
- ضع الفازلين على العينين لمنع الجفاف طوال العملية.
- احتفظ بالحيوان في غرفة انتعاش ساخنة حتى يصبح جاهزا لبدء الإجراء.
< p class = "jove_title" >
3. إجراء العملية الجراحية
ملاحظة: تأكد من تقنية التعقيم المناسبة لجميع خطوات الإجراء. يتضمن ذلك الاستخدام السليم للقفازات وشباك الشعر والأقنعة والستائر. يجب تعقيم جميع الأدوات قبل ملامسة.
- انقل إلى إطار تجسيمي ، الجانب الظهري لأعلى ، مرتفعا في القسم الأوسط بواسطة مناشف ورقية مطوية للمبالغة في انحناء العمود الفقري. اربط الذراعين والذيل بشريط جراحي وقم بتأمين الرأس بمشبك الأسنان. تثبيت قضبان الأذن ليس ضروريا لهذا الإجراء.
- استخدم مشرطا لعمل شق خط الوسط بطول 3 سم ، بدءا من أسفل الأذنين مباشرة وقطع في الاتجاه الذيلي.
- حدد موقع الفجوة بين الهيكلين الدهنيين الكبيرين واستخدم ملقطا دقيقا في كل يد لفصلهما. انشر الضاعرات لفتح المجال الجراحي.
- تحت المجهر الجراحي ، حدد موقع عملية النمو البارزة للفقرة الصدرية 2 (T2) (ملاحظة: هذه الميزة هي سمة من سمات سلالة الفأر C57BL / 6). قم بإجراء تشريح حاد باستخدام مقص زنبركي مغلق من خلال العضلات المتراكبة لتصور T2 بشكل أفضل. باستخدام الملقط ، تحسس الأسطح الصلبة للفقرة الصدرية 3 (T3) والفقرة الصدرية 4 (T4) لتأكيد الموقع التشريحي المناسب.
- باستخدام مقص زنبركي ، قم بعمل قطع جانبية ضحلة (بعمق 2-3 مم) للنسيج الضام بين T3 و T4. نظرا للتباعد الطبيعي بين الفقرات في الجزء العلوي الصدري من العمود الفقري للفأر ، فإن استئصال الصفيحة الفقرية غير ضروري للكشف عن الحبل الشوكي. ضع في اعتبارك أن الجرح العميق جدا سيخترق السلك ويتلفه.
ملاحظه: درجة صغيرة من النزيف شائعة خلال هذه الخطوة. إذا حدث هذا ، أمسك رمحا إسفنجيا في المنطقة حتى يهدأ النزيف (30-60 ثانية).
- تصور الحبل الشوكي. سيتم تغطيتها بطبقة سميكة من الجافية المرئية إذا لم يتم قطع هذه الطبقة السحائية بعد أثناء تعريض الحبل. يمر وعاء دموي بارز الذيلي/المنقاري عبر خط الوسط التقريبي للحبل الشوكي.
ملاحظه: لا ينبغي استخدام هذه الأوعية الدموية كمعلم لخط الوسط. بدلا من ذلك ، يجب أن تكشف الإضاءة الكافية عن حدود المادة الرمادية والبيضاء التي تحيط بالعمود الظهري ، والتي يجب استخدامها لتقدير خط الوسط.
- إذا ظلت الجافية سليمة ، فقم بعمل خدوش جانبية لطيفة بإبرة معدنية 32 جم حتى يتم إزالتها. الهدف هو إزالة الجافية مع عدم قطع السحايا الأساسية المتبقية ، والتي ليست سميكة ويصعب رؤيتها.
ملاحظه: يشير إطلاق السائل الدماغي النخاعي إلى خرق العنكبوتية ، وعلى الرغم من أن هذا يمكن أن يحدث دون تلف ميكانيكي للأنسجة ، يجب إزالة السائل الدماغي النخاعي المتراكم برمح إسفنجي لتصور سطح الحبل بشكل أفضل.
- حرك حقنة الحقن في مكانها وخفضها ببطء حتى يلامس طرف الشعيرات الدموية بالكاد الحبل الشوكي على الفور من جانبي خط الوسط. أغلق الذراع في مكانها.
- استخدم القياسات المتدرجة للذراع التجسيمي في الاتجاه Z لإجراء قياس موضع خط الأساس. من هذه القراءة ، اطرح 1.3 مم. استخدم حركة هبوطية سريعة وضحلة لثقب الأنسجة وخفض الشعيرات الدموية بعناية حتى يتم الوصول إلى القياس الجديد. اختياري: إذا رغبت في ذلك ، يمكن إنتاج الآفات في العمود الظهري بنفس الحركة الثقبة عند خط الوسط وعمق 0.3 مم.
ملاحظه: هذه القيم خاصة بالحقن بين T3 و T4. إذا اخترت إجراء الحقن في أي مكان آخر في الحبل الشوكي ، فيجب اشتقاق هذه القيم من أي أطلس دماغ فأر متاح.
- استخدام micromanipulator لخفض ليسوليسيثين في المادة البيضاء في الحبل الشوكي البطني. قم بإجراء دورة واحدة للمعالج الدقيق كل 5 ثوان لمدة دقيقتين ، مما ينتج عنه حجم نهائي يبلغ 0.5 ميكرولتر. اترك الشعيرات الدموية في مكانها لمدة دقيقتين إضافيتين لمنع ارتجاع المحلول ، ثم قم بإزالة الشعيرات الدموية بعناية.
- اربط خياطة واحدة في الأنسجة العضلية / الدهنية التي تتراكب العمود الفقري. استخدم خياطة غير متقطعة لإغلاق الجلد. ضع المزيد من اليود على موقع الشق.
- ضع في غرفة استرداد ساخنة حتى يتعافى ، ثم أعده إلى قفصه. ضع المسكنات بعد الجراحة وفقا للوائح رعاية المؤسسية. عادة ما تكون الرعاية الإضافية بعد الجراحة غير ضرورية لأن متنقلة بالكامل وقادرة على التغذية الذاتية والشرب بمجرد تعافيها من التخدير.
- كرر الإجراء للحيوانات المتبقية.
ملاحظه: مع الكفاءة ، يمكن إكمال العملية في 10-15 دقيقة لكل ، خاصة بمساعدة شخص ثان يربط الغرز. يمكن استخدام نفس الشعيرات الدموية الزجاجية في ما يقرب من 15-20 عملية جراحية قبل أن يصبح الطرف غير حاد ويجب استبداله. يمكن إجراء جراحات التحكم بشكل متماثل كما هو موضح ، مع حقن PBS في النخاع الشوكي بدلا من الليزوليسيثين. لا نوصي بتنظيف الشعيرات الدموية لاستخدامها في المستقبل.
