نقل الخلايا العصبية البشرية بوساطة الفيروسات العدسية لتحليل تجميع بروتين تاو

الملخص

المصدر: Aulston, B., et al. نموذج في المختبر لدراسة تراكم تاو باستخدام نقل الخلايا العصبية البشرية بوساطة الفيروسات.

يوضح هذا الفيديو عملية تحويل الخلايا العصبية البشرية بفيروس عدسي يشفر بروتين تاو بشري متحور ببروتين فلورسنت أصفر (YFP) لدراسة تراكم البروتين. يحدد الخطوات من دخول الفيروس إلى تعبير تاو المتحور ، وتبلغ ذروتها في تكوين مجاميع تاو السيتوبلازمية المرئية في الخلايا العصبية.

البروتوكول

1. تحضير الوسائط والكواشف

1. قم بإذابة طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي لألواح الثقافة عند 4 درجات مئوية (لا تسمح لمصفوفة الغشاء القاعدي بالتسخين ، وإلا فسوف تتصلب). اصنع 1 مل من الحصص وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية أو -70 درجة مئوية.
2. أعد تكوين عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) عند 10 ميكروغرام / مل وصنع 10 ميكرولتر من الحصص الصغيرة. قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. إلى زجاجة جديدة غير مفتوحة سعة 500 مل من DMEM / F12 مع الجلوتامين ، أضف B27 (10 مل) و N2 (5 مل) والبنسلين والستربتومايسين (5 مل). ضع 50 مل من وسائط الخلايا الجذعية العصبية (NSC) في أنبوب مخروطي الشكل وأضف 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / ميكرولتر (2 ميكروغرام / مل نهائي) bFGF. قم بتخزين وسائط NSC (+) bFGF عند 4 درجات مئوية.
4. لإنشاء وسائط (-) bFGF، استخدم نفس الوصفة كما هو موضح في الخطوة 1.3 ولكن لا تقم بإضافة bFGF. سيتم استخدام هذه الوسائط للتمييز بين الخلايا العصبية والخلايا العصبية والحفاظ على الثقافات العصبية بعد التمايز.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تركيبات العدسات الفيروسية

ملاحظة: قبل البدء في العمل مع تركيبات الفيروسات العدسية ، تأكد من الموافقة على المختبر لاستخدام عوامل السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL-2). علاوة على ذلك ، يجب استخدام أغطية الاستزراع BSL-2 ومعدات الحماية الشخصية (PPE) وطرق التخلص عند العمل مع نواقل الفيروسات العسسية.

1. الحصول على تركيبات تاو معبأة في فيروس العدسات من مصدر مفضل.

< ص الفئة = "jove_title" >3. زراعة الخلايا الجذعية العصبية البشرية

< p class = "jove_content" >ملاحظة: عادة ما يتم زرع الخلايا العصبية العصبية في 100,000-150,000 خلية / سم² وتباع معظم الخلايا العصبية المتوفرة تجاريا على شكل 1 × 10⁶ خلايا / قارورة. تم تحسين هذا البروتوكول لأطباق زراعة الخلايا مقاس 10 سم (على الرغم من أنه يمكن استخدام أحجام أخرى من الأطباق) ؛ لذلك ، إذا تم استخدام NSCs المتاحة تجاريا ، فقد تحتاج NSCs إلى التوسع من خلال استزراعها أولا في أطباق من ستة آبار من أجل الحصول على خلايا كافية لزرع أطباق 10 سم. يمكن بدلا من ذلك تكييف هذا البروتوكول مع مجموعة متنوعة من أحجام أطباق زراعة الخلايا.

1. لتحضير ألواح زراعة الخلايا ، قم بإزالة حصة واحدة من طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي المجمد لألواح زراعة الخلايا واتركها تذوب عند 4 درجات مئوية (يمكن وضع الحصص عند 4 درجات مئوية طوال الليل في اليوم السابق لزرع الخلايا). أضف 385 ميكرولتر من طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي إلى 5 مل من وسائط DMEM / F12 + البنسلين والستربتومايسين.
   ملاحظة: 5 مل من وسائط DMEM / F12 + البنسلين والستربتومايسين تكفي لطلاء طبق واحد مقاس 10 سم (1 مل من محلول طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي هذا يكفي لتغليف بئر واحد من طبق مكون من ستة آبار). بدلا من ذلك ، إذا كانت الخلايا ثابتة وملطخة بالمناعة ، أو تلطخها بالثيوفلافين ، فقم بزراعة الخلايا على أغطية زجاجية في أطباق مزرعة مكونة من 24 بئرا.
   1. حافظ على الوسائط وطلاء المصفوفة باردا قبل وإضافتها إلى أطباق الاستزراع. أضف طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي إلى أطباق الاستزراع وضع الأطباق في حاضنة (عند 37 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة. للحصول على الطلاء الأمثل ، لا تحتضن مصفوفة الغشاء القاعدي لأكثر من أو أقل من 1 ساعة. بعد 1 ساعة ، استنشق طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي من أطباق مزارع الخلايا. تأكد من أن هذا يتزامن مع جاهزية NSCs للطلاء.
      ملاحظه: إذا لم يتم إذابة الخلايا من المخزونات المجمدة ، فتخط الخطوة 3.2 وتابع الخطوة 3.3.
2. إذا تم إذابة الخلايا من مخزونات NSC المجمدة ، خذ قارورة من الخلايا المجمدة وقم بتسخينها في حمام مائي يتم تسخينه إلى 37 درجة مئوية عن طريق تحريك القارورة ذهابا وإيابا في الماء. بمجرد إذابتها ، رش القارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول وضعها في غطاء مزرعة الخلايا. انقل الخلايا إلى ~ 10 مل من وسائط DMEM / F12 + البنسلين والستربتومايسين وقم بالطرد المركزي للأنبوب في درجة حرارة الغرفة عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق. استنشاق الوسائط وإعادة تعليق الخلايا في وسائط NSC.
3. قم بتخفيف الخلايا في وسائط NSC للحصول على كثافة البذر المناسبة لوعاء زراعة الخلايا المستخدم.
   ملاحظه: على سبيل المثال ، إذا تم طلاء NSCs على صفيحة من ستة آبار - بئر واحد على طبق استزراع من ستة آبار تبلغ مساحة سطحه 9 سم² - يلزم وجود 900,000 إلى 1,350,000 خلية للبذر. لذلك ، يمكن إعادة تعليق قارورة واحدة تحتوي على 1،000،000 خلية في 2 مل من الوسائط وإضافتها إلى بئر واحد من طبق مكون من ستة آبار.
4. أضف ما يكفي من الخلايا المعلقة في وسائط NSC لبذر أطباق الثقافة المطلية بمصفوفة الغشاء السفلي (100,000 خلية / سم²) وتغيير الوسائط كل يومين (إذا كنت تستخدم مخزونا مجمدا ، فقم بتغيير الوسائط في اليوم التالي للطلاء وكل يومين بعد ذلك). قم بتنمية الخلايا حتى تصبح 75٪ -80٪ ملتقية.
   ملاحظه: من المحتمل أن تصل الخلايا إلى التقاء 75٪ -80٪ بعد فترة وجيزة من الطلاء ، ولكن هذا قد يستغرق وقتا أطول إذا تم استخدام المخزونات المجمدة.
5. بمجرد أن تكون NSCs متقاربة بنسبة 75٪ -80٪ ، ابدأ التمايز العصبي عن طريق إزالة وسائط NSC (+) bFGF واستبدالها بوسائط NSC (-) bFGF. استزراع الخلايا في هذه الوسائط (استبدال الوسائط كل يومين) لمدة 4 أسابيع على الأقل.
   ملاحظه: ستستمر الخلايا في الانقسام لبضعة أيام بعد سحب bFGF. لذلك ، قد تصل الخلايا إلى التقاء 90-100٪.
6. بعد الاستزراع لمدة 4 أسابيع ، ستحقق الخلايا مصيرا عصبيا وستكون جاهزة لعلاج فيروس العدس.

4. نقل وصيانة الثقافات العصبية

1. لتحويل الخلايا العصبية بفيروس العدسات ، استخدم عدد عيار 3.4 × 10⁵ وحدات / خلية قابلة للتحويل (طبق 100٪ ملتقى 10 سم سيحتوي على ~ 10 ملايين خلية عصبية). قم بتخفيف الوحدات القابلة للتحويل إلى التركيز اللازم في وسائط زراعة الخلايا وإضافتها إلى الخلايا (استخدم الحجم الطبيعي للوسائط لطبق زراعة الخلية). بعد يومين من إضافة فيروس العدسات ، اغسل الخلايا 1x بوسائط bFGF جديدة (-) (بدون فيروس عدس) واستمر في الزراعة في وسائط (-) bFGF كالمعتاد.
2. لعلاج ما بعد الفيروسات ، قم بتغذية الخلايا العصبية المنقولة عن طريق تغيير وسائط زراعة الخلية ([-] وسائط bFGF) كل يوم. حافظ على الخلايا لمدة ~ 8 أسابيع بعد التنبيغ. تصور الخلايا بشكل روتيني تحت المجهر الضوئي لضمان البقاء.
   ملاحظه: التناثر أو الكسور التغصنية هي علامات على أن الخلايا لم تعد قابلة للحياة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أطباق ثقافة 10 سم	الرصيد الحراري	12556002
50 مل أنابيب	بيوبايونيارد	CNT-50
70٪ إيثانول في زجاجة رذاذ	مصادر مختلفة	NA
ملحق B27	الرثروفرار	17504044
مصفوفة الغشاء القاعدي (Matrigel)	كورنينج	356231
FGF الأساسي	بيوبايونير	HRP-0011
ألبومين مصل الأبقار	سيجما	A7906
حاضنة زراعة الخلايا	مصادر مختلفة	NA
أجهزة الطرد المركزي	مصادر مختلفة	NA
وسائط مزرعة DMEM-F12 مع الجلوتامين	الرصيد الحراري	10565042
الإيثانول (تركيز 50٪ أو أعلى)	مصادر مختلفة	NA
الخلايا الجذعية العصبية البشرية	مصادر مختلفة	NA
النواقل الفيروسية العدسية	مصادر مختلفة	طلب مخصص
ملحق N2	الرصيد الحراري	17502048
البنسلين الستربتومايسين	الرثروفراز	15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	الرثروفراز	14190250
غطاء مزرعة الخلايا المعقمة	مصادر مختلفة	NA
حمام مائي	مصادر مختلفة	NA