قياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في الخلايا العصبية باستخدام قياس التدفق الخلوي

Abstract

المصدر: Liang، K. X.، et al. تحليل قياس التدفق الخلوي لمعلمات الميتوكوندريا المتعددة في الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ومشتقاتها العصبية والدبقية. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تصنيف الخلايا العصبية بالأجسام المضادة لمجمعات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ، والبروتين المرتبط بالحمض النووي للميتوكوندريا ، وبروتين الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، متبوعا بقياس التدفق الخلوي لتحديد مستوياتها.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. قياس التدفق الخلوي للوحدات الفرعية المعقدة MRC (سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا) و TFAM (عامل نسخ الميتوكوندريا A) في الخلايا الثابتة

1. في نهاية فترة الاستزراع ، افصل الخلايا (~ 10⁶) عن طريق إضافة كاشف تفكك الخلية ؛ ثم قم بالحبيبات وجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل. اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1x) مرتين عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
2. قم بتثبيت الخلايا في 1.6٪ بارافورمالدهيد (PFA) (1 مل من 1.6٪ PFA في أنبوب 15 مل) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام PBS (1x) مرتين عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
3. تخلل الخلايا بالثلج البارد 90٪ من الميثانول (1 مل من الميثانول 90٪ في أنبوب 15 مل) عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
4. قم بحظر العينات في مخزن مؤقت يحتوي على 0.3 M glycine و 5٪ مصل الماعز و 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) - الكسر V في PBS (1x) (1 مل من المخزن المؤقت المانع في أنبوب 15 مل). اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام PBS (1x) مرتين.
5. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الأولية التالية لمدة 30 دقيقة: مضاد NDUFB10 (1: 1,000) لقياس الوحدة الفرعية المعقدة الأولى ، الوحدة الفرعية لبروتين فلافوبروتين المركب المضاد للسكسينات A (SDHA ، 1: 1,000) لقياس الوحدة الفرعية المعقدة II ومضاد COX IV (1: 1,000) لقياس الوحدة الفرعية الرابعة المعقدة ، والجسم المضاد المضاد ل TFAM (عامل نسخ الميتوكوندريا A) المقترن مع Alexa Fluor 488 (1: 400). قم بتلطيخ نفس العدد من الخلايا بشكل منفصل باستخدام الجسم المضاد المضاد ل TOMM20 (ترانسلوكاز غشاء الميتوكوندريا الخارجي 20) المقترن ب Alexa Fluor 488 (1: 400) لمدة 30 دقيقة (1 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية في أنبوب 15 مل ؛ انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الأجسام المضادة).
6. اغسل الخلايا باستخدام PBS (1x) مرة واحدة بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أضف الجسم المضاد الثانوي (1: 400) في أنابيب NDUFB10 و SDHA و COX IV واحتضان الخلايا بهذه المحاليل لمدة 30 دقيقة.
7. اغسل الخلايا باستخدام PBS (1x) مرة واحدة عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق كريات الخلية في 300 ميكرولتر من PBS (1x). انقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل محفوظة في الظلام على الجليد.
8. قم بتحليل الخلايا الموجودة على مقياس التدفق الخلوي (بتكوين ليزر 3 أزرق و 1 أحمر). اكتشف الإشارات في المرشاح 1 (FL1) باستخدام مرشح ممر النطاق 530/30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
مضاد TFAM مقترن ب Alexa Fluor 488	أبكام	ab198308	الجسم المضاد الأساسي; استخدم ك 1: 400 ، 2.5 ميكرولتر في محلول تلطيخ 1000 ميكرولتر ؛ استخدم الماوس أحادي النسيلة IgG2b Alexa Fluor® 488 كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
مضاد TOMM20 مقترن ب Alexa Fluor 488	سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	الجسم المضاد الأساسي; استخدم ك 1: 400 ، 2.5 ميكرولتر في محلول تلطيخ 1000 ميكرولتر ؛ استخدم الماوس أحادي النسيلة IgG2a Alexa Fluor® 488 كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
مناهضة NDUFB10	أبكام	ab196019	الجسم المضاد الأساسي; استخدم ك 1: 1000 ، 1 ميكرولتر في محلول تلطيخ 1000 ميكرولتر ؛ استخدام Alexa Fluor ® 488 الماعز المضاد للأرانب IgG (1: 400 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي ؛ استخدم IgG أحادي النسيلة للأرانب كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
anti-SDHA	أبكام	ab137040	الجسم المضاد الأساسي; استخدم ك 1: 1000 ، 1 ميكرولتر في محلول تلطيخ 1000 ميكرولتر ؛ استخدام Alexa Fluor ® 488 الماعز المضاد للأرانب IgG (1: 400 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11008) كجسم مضاد ثانوي ؛ استخدم IgG أحادي النسيلة للأرانب كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
مكافحة كوكس الرابعة	أبكام	ab14744, RRID:AB_301443	الجسم المضاد الأساسي; استخدم ك 1: 1000 ، 1 ميكرولتر في محلول تلطيخ 1000 ميكرولتر ؛ استخدام Alexa Fluor ® 488 الماعز المضاد للفأر IgG (1: 400 ، Thermo Fisher Scientific ، كتالوج # A-11001) كجسم مضاد ثانوي ؛ استخدم IgG أحادي النسيلة للماوس كعنصر تحكم في النمط المتماثل.
برنامج تلفزيوني 1x	ثيرمو فيشر العلمي	18912014	تستخدم لغسل الدرجات
الفورمالديهايد (PFA) 16٪	ثيرمو فيشر العلمي	28908	تثبيت الخلية
جلايسين	سيجما ألدريتش	G8898	تستخدم في حظر المخزن المؤقت
ألبومين مصل الأبقار	أوروبا للمنتجات الحيوية	EQBAH62-1000	عامل مانع لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة في فحوصات التلوين المناعي ومكون آلية التنمية النظيفة