اختبار لوسيفيراز لقياس نشاط γ السيكريتاز في الخلايا البشرية

الملخص

المصدر: وانغ ، ب. ، وآخرون ، القياس الكمي لبروتين سلائف الأميلويد بوساطة γ سكريتاز وانقسام الشق في منصات فحص مراسل لوسيفيراز القائمة على الخلية. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو إجراء قياس نشاط γ السيكرتيز في الخلايا البشرية المعدلة وراثيا باستخدام نظام محفز للتتراسيكلين. تتضمن العملية تحفيز التعبير الجيني APP مع التتراسيكلين ، وتوليد ببتيدات β الأميلويد ، وتنشيط إنتاج لوسيفيراز. ثم يتم قياس التلألؤ البيولوجي الناتج عن تفاعل الركيزة اللوسيفيراز ، مما يعكس نشاط γ سيكريزيز.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. قياس إشارات مراسل لوسيفيراز ، والتي تتوافق مع انقسام γ-Secretase ل APP-C99 (بروتين سلائف الأميلويد - جزء من الأحماض الأمينية 99 الطرفية)

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى المنشورات السابقة للحصول على وصف تفصيلي لتوليد خلايا CG (C99-Gal4).

1. خلايا CG للبذور (20،000 خلية / بئر) على 96 بئر صفيحة دقيقة بحجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر / بئر في وسط النمو الذي يتكون من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) بالإضافة إلى 10٪ مصل بقري جنين (FBS) ، و 5 ميكروغرام / مل بلاستيسيدين ، و 250 ميكروغرام / مل مضاد حيوي (مثل الزيوسين) ، و 200 ميكروغرام / مل هيجروميسين ب.
   1. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
   2. انقل الصفائح الدقيقة إلى حاضنة CO₂ المرطبة واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
2. قم بإزالة 100 ميكرولتر من وسط النمو من كل بئر.
3. أضف 100 ميكرولتر / بئر من وسط النمو الذي يحتوي على 2 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين مع 0.2٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، 2 ميكرومتر CL-387،785 ، 2 ميكرومتر N- [N- (3،5-ثنائي فلورو فيناسيتيل-L-ألانيل)] -S-phenylglycine t-butylester (DAPT) ، أو مثبطات ErbB1 / ErbB2 الأخرى ذات الصلة.
4. احتضان خلايا CG المعالجة في صفائح دقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
5. قم بإزالة 150 ميكرولتر / وسط نمو البئر من الصفائح الدقيقة.
6. أضف 50 ميكرولتر / كاشف فحص لوسيفيراز جيدا (يرجى الاطلاع على جدول المواد).
7. انقل الصفائح الدقيقة إلى قارئ صفيحة دقيقة.
   1. حافظ على الألواح الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع تقليب لطيف.
8. حدد التلألؤ المنبعث من يراع لوسيفيراز (FL) باستخدام برنامج محدد مسبقا مخزن في قارئ اللفائح الدقيقة للتلألؤ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
قارئ لوحة تلألؤ VictorLight	PerkinElmer	2030-0010
خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية من النوع 2	علمي حراري	1300 Series A2
CL-387,785	EMD Calbiochem	233100-1MG
DAPT	ميرك	565770
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ثيرمو فيشر	12100046	المكون الرئيسي لوسط النمو
مصل الأبقار الجنينية (FBS)	ثيرمو فيشر	16000044
Blasticidin	ثيرمو فيشر	A1113903
زيوسين	ثيرمو فيشر	R25005
هيغروميسين ب	جيبكو	10687010
هيموسيتومير	سيجما ألدريتش	BR717805 ألدريتش
96 بئر صفيحة دقيقة	Nunc	156545
التتراسيكلين	سيجما	T7660
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	سيجما	D2650
Steady-Glo luciferase assay reagent	Promega	E2510
حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة	ريفكو	Ultima II
خط خلية T-REx293	Invitrogen	R71007
برنامج Wallac 1420 الإصدار 3.0	PerkinElmer		برنامج التحكم في الجهاز لقارئ اللفائح الدقيقة