$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.
< p class = "jove_title" >
1. تقطيع الدماغ
- لشل حركة وتخدير الفئران عن طريق تطبيق 3٪ إيزوفلوران.
- انقع كرة قطنية مع قطرات من الأيزوفلوران وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 15 مل. ضع أنف في الأنبوب واتركه يستنشق الأيزوفلوران. تحقق من عمق التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم.
- ضع على ظهره وقم بتثبيته عن طريق تثبيت أطرافه لأسفل بدبوس T أثناء الوصول إلى بطنه.
- اقطع بمقص جراحي ، وقص جلد البطن وقطع الجلد في منطقة الصدر. قم بتثبيت الجلد لأسفل باستخدام دبابيس T. ثم ، قم بكسر الغشاء البريتوني حتى الصدر. كشف القلب عن طريق تكسير التجويف الصدري وقطع الحجاب الحاجز.
- اقطع الأذين الأيمن للسماح للدم بالتدفق من. أدخل حقنة سعة 10 مل بإبرة قياس 25 في البطين الأيسر وقم بنفخ 10 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS).
ملاحظه: هذا يسمح للمحلول بالتدفق عبر الدورة الدموية الجهازية والخروج من خلال الأذين الأيمن.
- قم بإزالة المحقنة سعة 10 مل وأدخل إبرة قياس 25 متصلة بحقنة 60 مل. يتدفق من خلال البطين الأيسر مع 50 مل من المثلج البارد 4٪ بارافورمالدهيد (PFA).
- قم بإعداد محلول PFA المثلج البارد بنسبة 4٪ عن طريق تخفيف محلول PFA بنسبة 10٪ في H2O وتبريد محلول PFA النهائي بنسبة 4٪ عند 4 درجات مئوية.
- اعزل رأس الفأر وإزالة الدماغ من الجمجمة.
- قطع الجلد من الرقبة ، ثم قطع باتجاه العينين لفضح الجمجمة. اكسر الجمجمة من الرقبة إلى الأنف ، ثم من مقلة عين إلى أخرى. انزع الجمجمة واستئصال الدماغ كله.
- احتضان الدماغ في 4٪ PFA لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- انقل الدماغ بالملقط إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء ب 25 مل من محلول السكروز بنسبة 30٪. احتفظ بها عند 4 درجات مئوية لمدة 48-72 ساعة حتى يغرق الدماغ في قاع الأنبوب.
- قطع الدماغ باستخدام مصفوفة تقطيع دماغ الفأر البالغ الإكليلية من خلال الدماغ الأوسط (~ 3 مم خلف بريجما). احتفظ بقسم الدماغ الذي يحتوي على جذع الدماغ.
ملاحظه: سينتج عن ذلك قسمين للدماغ - أحدهما يحتوي على معظم القشرة (الجزء الأمامي من الجرح) والآخر يحتوي على جذع الدماغ / المخيخ (الجزء الخلفي من الجرح). استخدم قسم جذع الدماغ للخطوات التالية.
- قم بتضمين قسم جذع الدماغ مع وضع السطح المقطوع في الجزء السفلي من قالب التضمين ، محاطا بمركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) ؛ انقل الدماغ المدمج إلى فريزر -80 درجة مئوية وقم بتجميده لمدة 12 ساعة على الأقل - حتى الاستخدام الآخر.
- القطع في ناظم البرد: ضع قالب التضمين الذي يحتوي على الدماغ في OCT في ناظم البرد ؛ احتضنه في ناظم البرد لعدة ساعات لضبط درجة حرارة كتلة الدماغ مع درجة حرارة ناظم البرد.
- انزع قالب التضمين لكشف كتلة OCT التي تحتوي على الدماغ.
- استخدم شفرات الحلاقة لإزالة OCT الزائد من سطح الكتلة دون لمس الدماغ.
- قم بتركيب كتلة OCT على ظرف ناظم التبريد ، مما يكشف السطح المقطوع للدماغ باتجاه الأمام.
- اضبط السطح المقطوع للدماغ بحيث يتم توجيهه بالتوازي مع شفرات الحلاقة في الناظم الكريوستات.
- قم بقص الدماغ بدءا من النخاع ، وقطع أقسام 100 ميكرومتر بشكل روحي.
- تقليم الرأس حتى يتم قطع المخيخ وجذع الدماغ كشريحة واحدة متواصلة. ابدأ في جمع الشرائح بسمك 50 ميكرومتر.
ملاحظه: عندما يقطع المرء بشكل منحرف من النخاع ، سيتم قطع جذع الدماغ والمخيخ كقسمين منفصلين. في الأقسام المنقارية ، سيندمج جذع الدماغ والمخيخ في النهاية على مستوى البطين الرابع. بمجرد أن تتشكل الحواف الجانبية للبطين الرابع بشكل جيد ، سيخرج المخيخ وجذع الدماغ كشريحة واحدة مستمرة.
- اجمع شريحة دماغ محاطة ب OCT بالملقط وضعها في بئر من صفيحة 24 بئرا مملوءة ب PBS (الشكل 1 أ). سيكون الموضع اللولبي (LC) أكثر بروزا عندما يلتقي المخيخ والقولون السفلي ببعضهما البعض عند ~ -5.52 مم خلف بريجما (الشكل 2 ب).
ملاحظه: سيختفي الجزء الأمامي من LC بمجرد تقسيم المخيخ بالكامل ولم يعد يحيط بالقولون السفلي عند ~ -5.34 مم خلف بريجما (الشكل 2 ج).
< p class = "jove_title" >
2. الكيمياء المناعية للدوبامين β-هيدروكسيلاز (DBH) أو تيروزين هيدروكسيلاز (TH) (الشكل 1)
- اليوم 1
- اغسل الشرائح المحددة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في PBS.
- نفاذية لمدة 24 ساعة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات بنسبة 0.5٪ مع منظف (PBSD) عند 4 درجات مئوية.
- خفف 125 ميكرولتر من المنظفات في 25 مل من PBS.
- اليوم 2
- اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في 0.5٪ PBSD.
- أضف الجسم المضاد الأساسي ، المضاد ل DBH أو مضاد TH ، لمدة 18 ساعة عند تخفيف 1: 500 في 0.5٪ PBSD عند 4 درجات مئوية.
- اليوم 3
- اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في 0.5٪ PBSD.
- أضف الجسم المضاد الثانوي المطلوب (488 حمار مضاد للأرانب للتألق الأخضر) عند تخفيف 1: 1000 في 0.5٪ PBSD لمدة 16 ساعة.
- لف اللوحة المكونة من 24 بئرا بالألمنيوم وضعها على حرارة 4 درجات مئوية.
- اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في 0.5٪ PBSD.
- يغسل لمدة 5 دقائق في PBS.
- انقل الشرائح بفرشاة قلم رصاص إلى وعاء ماء.
- قم بتركيب شرائح تطفو في الماء على شرائح مشحونة.
- أقسام Coverslip مع وسائط التثبيت الصلبة الدوبامين بيتا هيدروكسيلاز
- جفف أقسام الدماغ المركبة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- صور شرائح الدماغ في مجهر متحد البؤر أو الفلورسنت مع إعدادات لاكتشاف الإشارات من الطول الموجي الفلوروفوري للأجسام المضادة الثانوية المناسبة.
- اضبط المجهر على المستوى البؤري لشريحة الدماغ والتقط صورة واحدة بتكبير 10X.
