وضع العلامات والزرع بوساطة الفيروسية لخلايا البروز العقدية الإنسية لدراسات In Vivo

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Vogt ، D. et al. ، وضع العلامات والزرع بوساطة فيروسية لخلايا البروز العقدي الإنسي (MGE) للدراسات في الجسم الحي.J. Vis. Exp.(2015).

يوضح هذا الفيديو وضع العلامات الفيروسية وزرع خلايا البروز العقدي الإنسي (MGE) للدراسات في الجسم الحي. يحدد الخطوات المتبعة في نقل خلايا MGE مع محضر فيروسي ، وزرع هذه الخلايا المنقولة في قشرة جرو الفأر ، وتمكين التعبير المراسل في أنواع فرعية محددة من الخلايا العصبية الداخلية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالنماذج الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير فيروس العدسات (خطوة اختيارية)

1. قم بتقسيم ثلاث ألواح مقاس 10 سم من الخلايا HEK293T لكل فيروس عدسي يتم تصنيعه في وجود 10 مل من DMEM / 10٪ FBS وتنمو إلى ~ 60-70٪ التقاء. قم بزراعة الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
2. قم بنقل بلازميدات الحمض النووي التالية (إجمالي 10 ميكروغرام) في كل لوحة باستخدام أي كاشف تعداد: 6.4 ميكروغرام من ناقل الفيروسات العدسية CAG-Flex-GFP ، و 1.2 ميكروغرام pMD2.G (يشفر VSV-g) ، و 1.2 ميكروغرام pRSV-Rev ، و 1.2 ميكروغرام pMDLg / pRRE. نواقل التعبئة والتغليف الفيروسية الثلاثة متاحة تجاريا.
   ملاحظة: يستخدم هذا النهج نواقل الفيروسات النسائية من الجيل الثالث ، لكن نواقل الجيل الثاني والبلازميدات المرتبطة بها ستعمل أيضا.
3. قم بإعداد حاوية نفايات تحتوي على محلول مبيض بنسبة 10٪ داخل غطاء معتمد من BSL2 لتعطيل أي محاليل أو أجهزة تلامس أو تحتوي على فيروس العدس. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسائط تماما بعد 4-6 ساعات من التعداء في محلول التبييض ، واستبدلها بنفس الحجم من الوسائط الجديدة ، واسمح للخلايا بالنمو.
4. بعد 4 أيام ، اجمع الوسائط في 50 مل من الأنابيب المخروطية وأجهزة الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 15 دقيقة لحبيبات أي بقايا خلية. بعد ذلك ، قم بتصفية المادة الطافية من خلال غشاء 0.45 ميكرومتر. أي مرشح ربط منخفض البروتين ، مثل PVDF ، يعمل بشكل جيد. تحذير: ضع كل من النفايات الفيروسية الصلبة والسائلة في محلول التبييض.
5. قم بتحميل 30 مل من المادة الطافية المفلترة في أنابيب الطرد المركزي الفائق وفي جهاز طرد مركزي فائق. جهاز طرد مركزي عند 100,000 × جم لمدة 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية. افتح أنابيب أجهزة الطرد المركزي في غطاء محرك BSL2 وقم بإزالة المادة الطافية في مبيض بنسبة 10٪. أضف ~ 100 ميكرولتر من PBS إلى الحبيبات ، مما ينتج عيارات 1x10 ⁷ إلى 1x10 ⁸ وحدات معدية / مل. Aliquot في اليوم التالي وتخزينها في -80 درجة مئوية.
6. اعتبار مهم: العديد من المؤسسات لديها الآن نوى فيروسية. الحصول على فيروس مركز بحد أدنى 1x10⁷ وحدات معدية / مل ، للحصول على أفضل النتائج.

2. الفئران المانحة لتشريح MGE

1. أولا ، قم بإعداد تزاوج موقوت بين خط الاهتمام الذي يعبر عن Cre وإما ماوس من النوع البري (WT) أو ماوس يعبر عن المراسل بعد إعادة التركيب بوساطة Cre.
   ملاحظة: العديد من خطوط Cre-driver معدلة وراثيا ويتم صيانتها وتربيتها في حالة نصفي. وبالتالي ، فإن نصف الأجنة فقط ستحتوي على الجين المعدل Cre. يمكن تحضير الحمض النووي بسرعة من الأجنة لاختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل قصير للكشف عن أليل Cre. يمكن بعد ذلك حصاد أجنة Cre ⁺ بحيث يتم استخدام أنسجة MGE فقط من النمط الجيني المطلوب. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مراسل معتمد على Cre لاختيار الأجنة لتشريح MGE وزرعه.
2. احسب اليوم الذي يتوافق مع E13.5. إذا تم إقران في المساء السابق ، فإن يوم القابس هو 0.5. اطلب الفئران الحامل في الوقت المناسب أو أنثى WT مع صغار P1 من أجل تحديد وقت وجود فئران ما بعد الولادة (P) 1 في اليوم الذي سيكون فيه النسيج المتبرع E13.5. بدلا من ذلك ، قم بإعداد هذه التزاوج في المنزل قبل أسبوع واحد من إقران المتبرعة.
   ملاحظة: غالبا ما يكون من الصعب القيام بالاستراتيجية السابقة المتمثلة في توليد كل من الأجنة / الجراء E13.5 و P1 لنفس اليوم بشكل موثوق.

3. إعداد الوسائط والأدوات والمعدات.

1. قم بإعداد الكواشف والأدوات لإعداد خلية MGE ( الجدول 1 ).
   1. قم بإعداد سطح نظيف وضع ملقطا نظيفا ومقصا وإما سكينا جراحيا مجهريا أو ملقطا دقيقا (لتشريح الأنسجة بدقة) على السطح.
   2. تحضير محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) للتشريح ووسط النسر المعدل من Dulbeco (DMEM) مع مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS) للنقل.
   3. احتضان 20-30 مل DMEM/10٪ FBS في حاضنة زراعة الأنسجة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة تقريبا. يجب فك الغطاء للسماح بتبادل الغازات وموازنة الأس الهيدروجيني للوسائط.
      ملاحظة: يمكن تحضير الحضانة المسبقة للوسائط قبل بدء التشريح مباشرة.

4. تحضير خلية MGE

1. قم بالتضحية بالفأر الحامل وفقا لبروتوكول حيواني معتمد وقم بإزالة الأجنة في طبق بتري مقاس 10 سم يحتوي على HBSS مثلج.
2. قم بإزالة الدماغ من كل جنين باستخدام منظار تشريح (قم بعمل واحد تلو الآخر ، مع ترك بقية الأجنة في HBSS شديد البرودة) ثم انتقل إلى قطع أنسجة MGE.
   ملاحظة: المفصلة أدناه وفي الشكل 1 هي خطوات رئيسية توضح كيفية إزالة MGE.
   1. ضع الدماغ بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى ( الأشكال 1 أ ، أ ). ملاحظة: لا بأس أيضا أن يكون الجانب الظهري متجها لأعلى. اقطع الدماغ إلى نصفين على طول المستوى السهمي لتوليد قطعتين. يظهر مثال على الدماغ المنقسم ( الأشكال 1 ب ، ب ') ؛ لاحظ أن الجوانب الظهرية (القشرة العلوية) والجوانب البطنية للدماغ تغطي وتحيط بأنسجة البروز العقدي (GE).
   2. بعد ذلك ، باليد المهيمنة ، أمسك إما ملقطا دقيقا جدا أو سكين طعنة ( الجدول 1 ) أثناء شل حركة نصف الكرة الأرضية بالملقط الذي تمسك به يد غير مهيمنة. (يجب أن يكون الجانب الإنسي لنصف الكرة الأرضية متجها لأعلى). افتح الأنسجة الظهرية والبطنية بالملقط وسكين طعنة للكشف عن الأنسجة المعدلة وراثيا الأساسية ( الشكل 1C ومرسوم في الشكل 1C').
      ملاحظة: يمكن أن تؤدي إزالة بعض الوسائط من طبق بتري التشريح إلى تسهيل تثبيت الأنسجة أثناء إجراء تشريح MGE.
   3. قم بعمل قطع مستقيمة بسكين الطعن أو الملقط الدقيق لفصل أنسجة CGE و LGE والحاجز (انظر مثال التخفيضات المشار إليها بخطوط متقطعة حمراء ، الشكلان 1D و D'). يمكن إجراء هذه التخفيضات بأي ترتيب.
      ملاحظة: تخيل MGE على أنه "صندوق" مقطوع من الأنسجة المحيطة. يساعد القيام بذلك على إجراء جروح مماثلة بشكل متكرر لكل تشريح ، وبالتالي تقليل التباين في تشريح الأنسجة.
   4. أخيرا ، اقلب MGE على جانبه وقم بقص الجزء السفلي (ما هو الجانب الجانبي للدماغ). هذا يزيل منطقة عباءة MGE (تجاهل في الشكلان 1E و 1E ') من بقية MGE. يحتوي الجانب المتبقي من MGE بشكل أساسي على أجزاء المنطقة البطينية والمنطقة تحت البطينية من MGE ، والتي تحتوي على جميع الخلايا السلفية MGE تقريبا. تابع مع هذا الأنسجة.
3. اعتبار مهم: يمكن أن تكون إضافة هلام السيليكون إلى قاع طبق بتري بمثابة سطح تشريح ممتاز لأنه يحمي الأطراف الحساسة للملقط ويوفر سطحا ناعما لتثبيت الأنسجة بالملقط.

5. وضع العلامات على الفيروسات العدسية وزرعها

1. انقل أنابيب أنسجة MGE إلى غطاء محرك معتمد من BSL2 وقم بإزالة الوسائط.
   ملاحظة: أنسجة MGE كبيرة بما يكفي لتكون مرئية وستستقر في قاع الأنبوب ، مما يسمح بإزالة الوسائط الباردة بسهولة وبلطف.
2. أضف ~ 500 ميكرولتر من وسائط DMEM / 10٪ FBS ، والتي تم تحضينها مسبقا في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف البوليبرين لتسهيل النقل إلى كل أنبوب بتركيز نهائي قدره 8 ميكروغرام / مل. قم بترتيث أنسجة MGE لإنشاء معلق خلية واحدة باستخدام طرف ماصة P1000. أخيرا ، أضف ~ 15-20 ميكرولتر من فيروس العدسي المركز إلى كل أنبوب.
3. اعتبار مهم: يكفي التخلي من 10 إلى 12 مرة لتفتيت أنسجة MGE من جنين واحد ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من عمليات التجارب إذا تم تجميع العديد من MGEs معا. جرب شروط التجربة المختلفة لتحديد ما هو الأفضل.
4. أغلق كل أنبوب بإحكام ، واقلبه للخلط ، ثم ضع جميع الأنابيب في حاضنة 37 درجة مئوية. احتضان الخلايا في فيروس العدسات لمدة 30 دقيقة على الأقل وحتى ساعة واحدة ، أدت الأوقات الأطول إلى انخفاض قابلية الخلايا للبقاء. اقلب الأنابيب كل 10 دقائق حتى يحين الوقت.
5. بعد الحضانة بفيروس العدسات ، قم بإزالة الأنابيب من الحاضنة وجهاز الطرد المركزي عند ~ 700 × جم لمدة 3 دقائق لحبيبات الخلايا. في غطاء محرك BSL2 ، قم بإزالة المادة الطافية وتخلص منها في مبيض بنسبة 10٪. بعد ذلك ، أضف 1 مل DMEM / 10٪ FBS وقم بتقطيع الحبيبات 2-3 مرات لغسلها ، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى بنفس السرعة لحبيبات الخلايا. كرر خطوة الغسيل هذه 2-3 مرات أخرى لإزالة الفيروسات الزائدة.
   ملاحظة: قم بإجراء خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ؛ ومع ذلك ، لم يلاحظ انخفاض الجدوى عند إجراء الدورات القصيرة في RT.
6. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط وضع كل أنبوب على الثلج. بسبب الوسائط المتبقية على جانبي الأنبوب ، سينتهي الأمر ~ 2-3 ميكرولتر من الوسائط بتغطية حبيبات الخلية بحلول الوقت الذي تبدأ فيه عملية الزرع.

6. الزرع والتحقق من الصحة

1. احصل على صغار المضيف P1 وقم بإعداد منطقة الإجراء عن طريق رش 70٪ من الإيثانول. للحفاظ على العقم أثناء الإجراء ، يوصى بإجراء هذه الإجراءات في غرفة إجراءات نظيفة مخصصة. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم الأدوات الجراحية المعقمة وقم بتعقيم الأسطح التي سيلامس بها الجراء ، باستخدام 70٪ من الإيثانول. يظهر مثال على المعدات التمثيلية اللازمة لإجراء عمليات الزرع ، ومنطقة الإجراء التمثيلي ، في الشكل 2 .
   ملاحظة: في حين أن هذا الإجراء عبارة عن حقن بكميات صغيرة ، وليس إجراء جراحيا يتطلب شقا أو جرحا مفتوحا أو خيوطا جراحية ، إلا أنه لا يزال من المستحسن استخدام ماصة دقيقة جديدة لكل فأر يتم حقنه. يتم تعقيم الماصات الدقيقة بالحرارة عند سحبها وشطفها على سطح تم رشه بنسبة 70٪ من الإيثانول يتم تخزينه في حاوية محكمة الغلق.
   1. قم بتوليد ماصات دقيقة بقطر يتراوح قطرها عند الطرف بين 40-80 ميكرومتر. اتباع هذه الأبعاد سيؤدي إلى أفضل النتائج. قم بتعقيم الماصات الدقيقة بالحرارة عند سحبها وشطفها على سطح ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل تخزين الماصات الدقيقة في حاوية محكمة الغلق.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، إذا كان الوصول إلى الأجهزة اللازمة لإنشاء هذه الإبر (جدول 1) محدودا، فاستخدم أي جهاز حقن آخر. ومع ذلك، قد لا تكون هذه مناسبة تماما مثل الماصات الدقيقة بسبب اختلاف الأقطار.
   2. اسحب الزيت المعدني في حقنة سعة 1 مل ، وباستخدام إبرة 30 1/2 جم ، املأ الماصة الزجاجية بالكامل بالزيت المعدني. بعد ذلك ، قم بتركيب المكبس على الجهاز التجسيمي ، ثم قم بتوصيل الماصة الزجاجية بالجهاز التجسيمي وقم بتحميلها على المكبس. باستخدام المحرك الهيدروليكي ، حرك المكبس في منتصف الطريق تقريبا إلى الماصة الزجاجية ، وقم بإزالة الزيت المعدني الذي ينسكب بمنشفة ورقية نظيفة.
      1. بديل لاستخدام المحقنة، اغمر الطرف الخلفي من الماصة في الزيت المعدني واملأه بعمل الشعيرات الدموية. لمنع فقاعات الهواء في الماصة، حافظ على الضغط الإيجابي على المحقنة حتى تخرج تماما من الماصة الزجاجية.
         ملاحظة: يمكن استخدام أجهزة أخرى لزرع خلايا MGE بنجاح. أي جهاز يمكنه توصيل حجم أقل من أو بالقرب من 100 nl يعمل بشكل جيد لهذا الإجراء.
   3. بعد ذلك ، استخدم منشفة ورقية معقمة أو أي مادة ماصة ، مع لف الزاوية في نقطة دقيقة لإزالة الوسائط الزائدة بدقة فوق حبيبات خلية MGE. تركز هذه الخطوة كثافة الخلية بحيث يمكن تحقيق أحجام حقن أصغر. بعد ذلك ، استخدم ماصة منخفضة الحجم (يفضل P2) لسحب حبيبات الخلية ببطء وثلاثية 1-2 مرات قبل تحريك تعليق الخلية على سطح كاره للماء. يجب أن يكون الحجم أقل بقليل من 1 ميكرولتر. حرك طرف الإبرة إلى تعليق الخلية وباستخدام المحرك الهيدروليكي ، ارسم تعليق الخلية في الماصة.
   4. تخدير جرو P1 عن طريق انخفاض حرارة الجسم (لفه في قفاز من اللاتكس وضعه على الثلج لمدة ~ 2-4 دقائق). تحقق من فعالية التخدير مع المنبه الضار. اقرص الجلد بين أصابع القدم بالملقط الرفيع: يجب أن يكون الجرو غير مستجيب إذا تم ضغطه. بعد ذلك ، ضع الجرو على قالب موجود أسفل جهاز الحقن ، ثم اجعل الجلد مشدودا عن طريق سحب الجلد للخلف على الرأس وتثبيته بشريط مختبر قياسي.
      ملاحظة: في حين أن انخفاض حرارة الجسم فعال جدا على الفئران حديثي الولادة ويؤدي إلى انخفاض معدل الوفيات ، يجب إجراء الإجراءات بسرعة ، حيث ستبدأ الجراء في التعافي في أقل من 10 دقائق. بالإضافة إلى ذلك ، فإن 4 دقائق على الجليد هي الحد الأعلى لما يمكن تحمله. حاول إحداث انخفاض حرارة الجسم مرة واحدة فقط إذا كانت هناك حاجة إلى وقت أطول للحقن. ومع ذلك ، إذا تعافى الجرو مبكرا ، فاسمح أولا للجرو بالتعافي تماما قبل إحداث انخفاض حرارة الجسم مرة أخرى. علاوة على ذلك ، قم فقط بتحفيز انخفاض حرارة الجسم مرة أخرى لإجراء الحقن. سوف تتعافى الجراء في غضون 5-10 دقائق من انخفاض حرارة الجسم. يمكن تسهيل ذلك عن طريق وضع الجراء مع القمامة والأم أو عن طريق وضع الجرو على سطح دافئ للتعافي.
   5. باستخدام جهاز تجسيمي ، ضع طرف الماصة الزجاجية على السطح على رأس الجرو ، عموديا على سطح الرأس. عندما تكون الماصة ملامسة للرأس، اعتبر ذلك "0". بعد ذلك ، ادفع الماصة عبر سطح الجلد والجمجمة إلى القشرة ، ثم أدخل الماصة وسحبها ~ 2 مرات قبل التوقف. للاستهداف الأمثل للخلايا في القشرة المخية الحديثة ، يتم إجراء الحقن عندما تكون الماصة الدقيقة على عمق 0.1 مم. ومع ذلك ، يجب تحسين ذلك من قبل المستخدم (انظر الملاحظة أدناه).
      ملاحظة: في حين أن هذا العمق يستهدف بشكل موثوق طبقات القشرة الحديثة العميقة باستخدام الأجهزة الموضحة أعلاه ، يجب اختبار بعض الأعماق وتحديدها تجريبيا. بالإضافة إلى ذلك ، يجب اختبار مجموعة من الأعماق في مواقع مختلفة من المذيلية والمتوسطة الجانبية لتحديد العمق الأمثل في كل موقع. أيضا ، يجب أن يكون الثقب الأولي سريعا ، حيث أن الاختراق البطيء في القشرة المخية الحديثة يقلل من القدرة على اختراق الأنسجة بشكل نظيف. جرب سرعات مختلفة عند بدء هذا الإجراء لأول مرة للعثور على ما هو أفضل. بالإضافة إلى ذلك ، لاختبار الإحداثيات ، لا يوجد بديل حقيقي لاستخدام الخلايا المصنفة ، حيث لم تكن الأصباغ موثوقة للدلالة على الموضع.
   6. بمجرد أن تصبح الإبرة في موضعها ، قم بتدوير الجهاز الهيدروليكي لدفع المكبس إلى الماصة الزجاجية ، ودفع حجم محدد من تعليق الخلية إلى القشرة. حقن 50-70 nls لكل موقع. كرر هذا الإجراء في 3-6 مواقع مختلفة على مستويات ذيلية منقولية مختلفة إذا كان الهدف هو الحصول على توزيع واسع للخلايا في جميع أنحاء القشرة المخية الحديثة.
      ملاحظة: يمكن أن تسبب الأحجام التي يبلغ حجمها 100 nl أو أكثر آفات وتؤدي إلى كتل كبيرة من الخلايا المحقونة التي تفشل في الهجرة بكفاءة خارج موقع الحقن. وبالتالي ، فإن أحجام الحقن الأصغر (~ 70 nl أو أقل) هي الأمثل ، في المزيد من المواقع إذا سمح الوقت بذلك.
   7. عند اكتمال الحقن ، أخرج الجرو من المسرح وقم بتمييزه (قص إصبع القدم هو طريقة موثوقة للتعرف على الجراء لاحقا). بمجرد أن يتعافى الجرو ويصبح قادرا على التحرك من تلقاء نفسه (يحدث هذا في غضون دقائق من إزالته من المسرح) ، أعده مع الأم والقمامة.
      ملاحظة: نظرا لأن هذا إجراء طفيف التوغل ، فلا توجد إجراءات ما بعد الجراحة بمجرد أن يتحرك الجرو بحرية ويسخن. ومع ذلك ، يجب فحص الجراء ليس فقط بعد العملية ولكن أيضا في اليوم التالي للتأكد من عدم وجود علامات على تدهور صحتهم.
   8. قبل البدء في الإجراء على الجرو التالي ، رش المنطقة بنسبة 70٪ من الإيثانول للحفاظ على منطقة عمل معقمة. اسمح للجراء المحقونة بالتطور ثم تقييم الأنسجة في مرحلة (مراحل) النمو المناسبة.

الجدول 1. قائمة جرد الكواشف والأدوات. جرد للكواشف المتاحة تجاريا بما في ذلك الوسائط وأدوات التشريح والمعدات التمثيلية للزرع ونواقل الحمض النووي. (ن.) غير متوفر أو قابل للتطبيق.

الكواشف والمعدات لتحضير خلايا MGE ونقلها			كتالوج #	الشركة
1)	وسط النسر المعدل من Dulbecco ، مع نسبة عالية من الجلوكوز		12491-015	تقنيات الحياة
2)	مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة		10437-077	تقنيات الحياة
3)	محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) ، بدون كالسيوم أو مغنيسيوم		14170-112	تقنيات الحياة
4)	أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل (أو أنابيب تجميع أخرى بأغطية)		3810X	إيبندورف الدولية
5)	Polybrene		SC-134220	سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية
6)	سكين طعن مستقيم 22.5 درجة (اختياري)		المرجع 72-2201	مؤسسة التخصصات الجراحية
7)	طبق بتري (10 سم) ، لتشريح الأنسجة		FB0875713	فيشر العلمي
8)	2 ملقط طرف ناعم ، مثل Dumont # 5		11254-20	الأدوات العلمية الدقيقة
9)	37 درجة مئوية حاضنة زراعة الأنسجة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 مدخل		C150	الموثق
10)	جهاز طرد مركزي منضدي يمكنه تدوير أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل
11)	أي ماصة P1000 يمكن استخدامها لخلية التخلي
12)	غطاء السلامة الحيوية من المستوى 2
الكواشف والمعدات لثقافات MGE الأولية في المختبر			كتالوج #	الشركة
1)	شرائح غرفة Lab-TekII مع غطاء ، 8 بئر		154941	ثيرمو فيشر
2)	بولي إل ليسين 0.1٪ وزن / حجم		P8920	سيجما ألدريتش
3)	لامينين الفأر ، 0.5-2 مجم / مل		23017-015	تقنيات الحياة
4)	الوسط العصبي القاعدي		21103-049	تقنيات الحياة
5)	مكمل غذائي خال من مصل B27		17504044	تقنيات الحياة
6)	جلوتاماكس ، مخزون 100 ضعف		35050-061	تقنيات الحياة
7)	البنسلين الستربتومايسين ، مخزون 100 ضعف		15070-063	تقنيات الحياة
8)	الجلوكوز ، (تحضير محلول 25٪ في الماء)		G5400	سيجما ألدريتش
الكواشف والمعدات لزرع خلايا MGE			كتالوج #	الشركة
1)	حقنة 1 مل		المرجع 309602	BD و Becton Dickinson وشركاه
2)	30 1/2 غ إبرة		305106	BD و Becton Dickinson وشركاه
3)	تجويف دقيق لتوصيل 5 ميكرولتر (يأتي مع مكبس)		5-000-1005	شركة دروموند العلمية
4)	بارافيلم		PM-999	شركة Polysciences، Inc.
5) **	مجهر استريو مع حامل ذراع الرافعة		MZ6	لايكا
6) **	رقمي فقط للفئران أداة تجسيمية		51725D	شركة ستويلتينج
7) **	مناور دقيق دقيق هيدروليكي أحادي المحور		MO-10	ناريشيجي
8)	شطبة دوارة مطلية بالماس		n.a.	صنع في المنزل
9)	مجتذب ماصة الإبرة		730	أدوات Kopf
10)	الزيوت المعدنية		n.a.	أي صيدلية أو صيدلية
11)	أي ماصة وأطراف يمكنها قياس الحجم 1 ميكرولتر بشكل موثوق
	** هذه هي النماذج التي نستخدمها ، ولكن يجب أن تعمل العديد من الإعدادات الأخرى
الكواشف الاختيارية (لصنع فيروسات العدس)			كتالوج #	الشركة
1)	25 مم ، مرشح 0.45 ميكرومتر		09-719B	فيشر العلمي
2)	أنابيب طرد مركزي فائقة الوضوح (25 × 89 مم)		344058	بيكمان كولتر®
3)	ليبوفيكتامين 2000	(حجم 1.5 مل)	11668019	Invitrogen
اللوازم الأخرى المتاحة تجاريا			كتالوج #	الشركة
1)	pMDLg/pRRE بلازميد ترميز gag/pol		12251	Addgene
2)	pRSV-Rev ترميز البلازميد Rev		12253	Addgene
3)	pMD2.G بلازميد ترميز VSVG		12259	Addgene
4)	pAAV-Flex-GFP		28304	Addgene

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. إجراء تمثيلي لتشريح أنسجة E13.5 MGE.مثال على تشريح أنسجة MGE إما للثقافات الأولية أو عمليات الزرع. (A-E) صور لتشريح الدماغ E13.5 ، و (A'-E') لتسليط الضوء على الهياكل والخطوات المهمة في الإجراء. (أ ، أ) ينظر إلى دماغ الممثل E13.5 من الجانب البطني. يشير الخط الأحمر إلى القطع الأول الذي تم إجراؤه ، والذي سيقسم الدماغ إلى قطعتين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكواشف والمعدات لزرع خلايا MGE حقنة 1 مل المرجع 309602 BD ، بيكتون ديكنسون وشركاه 301/2 إبرة قياس 305106 BD ، بيكتون ديكنسون وشركاه تجويف دقيق لتسليم 5 ميكرولتر (يأتي مع مكبس) 5-000-1005 شركة دروموند العلمية بارافيلم PM-999 Polysciences، Inc. مجهر ستيريو مع حامل ذراع الرافعة ** ميز6 لايكا رقمي فقط للفئران أداة التجسيم ** 51725 د شركة ستويلتينج مناور دقيق دقيق هيدروليكي أحادي المحور ** MO-10 ناريشيجي الماس المطلي بالماس الروتاري ن. صنع في المنزل مجتذب ماصة الإبرة 730 ريال أدوات Kopf الزيوت المعدنية ن. أي صيدلية أو صيدلية أي ماصة وأطراف يمكن أن تقيس 1 ميكرولتر من الحجم ** هذه هي النماذج المعينة التي نستخدمها ، ولكن يجب أن تعمل العديد من الإعدادات الأخرى الكواشف الاختيارية (لصنع فيروسات العدس) مرشح 25 مم ، 0.45 ميكرومتر 09-719 ب فيشر ساينتيك أنابيب الطرد المركزي فائقة الوضوح (25 × 89 مم) 344058 بيكمان كولتر® ليبوفيكتامين 2000 (حجم 1.5 مل) 11668019 إنفيتروجين الإمدادات الأخرى المتوفرة تجاريا pMDLg / pRRE بلازميد ترميز هفوة / بول هاتف 12251 أدجين pRSV-Rev ترميز البلازميد Rev هاتف 12253 أدجين pMD2.G ترميز البلازميد VSVG هاتف 12259 أدجين pAAV-فليكس-GFP هاتف: 28304 أدجين