$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. إجراء ما قبل الجراحة
- قبل البدء في الجراحة ، امسح كل شيء بنسبة 70٪ من الإيثانول للحفاظ على ظروف معقمة. يوصى بالدعم الحراري باستخدام وسادة التدفئة.
- تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من هيدرات الكلورال (400 مجم / كغ). تأكيد التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم. يوصى باستخدام ميلوكسيكام SR عند الحث والبوبرينورفين عند التعافي BID (مكرر في الموت ، مرتين في اليوم) لمدة 24 ساعة على الأقل.
- احلق الشعر باستخدام ماكينة قص جراحية. قم بتثبيت الفأر في الفأر ومحول الفئران حديثي الولادة باستخدام قضبان الأذن ومشبك الأنف.
ملاحظه: من الأهمية بمكان التأكد من أن رأس الماوس مؤمن في هذه المرحلة ولا يتحرك جنبا إلى جنب.
- ضع مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
< p class = "jove_title" >
2. الجراحة التجسيمية لتوجيه زرع القنية
- اضبط محول الفأر والفئران حديثي الولادة على الجهاز التجسيمي. قم بعمل شق سهمي على الجلد فوق الجمجمة باستخدام مشرط. امسح الدم والنسيج الضام على الجمجمة باستخدام قطعة قطن مبللة.
- تحديد إحداثيات منطقة الدماغ التي تهمك باستخدام أطلس الدماغ. قبل البدء في القياسات ، تأكد من أن خط الوسط مستقيم بحيث يمكن تحريك لقمة الحفر من AP والبقاء على خياطة خط الوسط طوال الوقت.
ملاحظه: تستخدم هذه المقالة الإحداثيات (A / P: -3.1 مم ، M / L: -2.5 مم ، D / V: -1.2 مم ، 12 درجة) لاستهداف الحصين الخلفي.
- مستوى الجمجمة A-P
- نعلق مثقاب على مناور من الإطار التجسيم. اخفض المثقاب حتى يلامس لامدا برفق وسجل إحداثياته البطنية. كرر هذا الإجراء ل bregma.
ملاحظه: عندما يتم تسوية الجمجمة ، يكون القياس الرأسي للبريجما مساويا لقياس لامدا. إذا لم يكن كذلك ، فاضبط ارتفاع مشبك الأنف وفقا لذلك. بعد تسوية الجمجمة ، سجل الإحداثيات الأمامية / الخلفية الجانبية للبريجما.
- مستوى الجمجمة من اليسار إلى اليمين
- انقل المثقاب من بريجما إلى الإحداثي (الأمامي الخلفي [A / P]: -3.1 مم ، متوسط الوحشي [M / L]: + 2.0 مم) ، اخفض المثقاب إلى الجمجمة وسجل الإحداثيات الرأسية. ثم كرر هذا الإجراء للإحداثيات (A / P: -3.1 مم ، M / L: -2.0 مم).
ملاحظه: إذا كانت الجمجمة مستوية ، فإن هذه القياسات الرأسية لنقطتين متساويتين المسافة من خط الوسط متساوية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط ارتفاع قضبان الأذن.
- قم بحفر ثقب لدغ بعناية عند الإحداثيات المستهدفة (A / P: -3.1 مم ، M / L: -2.5 مم) لزرع قنية توجيهية. إذا لم يكن قطر ثقب الأزيز كبيرا بما يكفي لزرع قنية التوجيه ، فقم بحفر ثقب آخر يتداخل مع الثقب الأول. حفر ثقب آخر على العظم الجداري الأيمن (الجانب المقابل) وأدخل المسمار العظمي ، مما يساعد على تأمين الأسمنت السني في 1.10 (انظر الشكل 1 ب).
- قم بقص قطعة قفل دائرية من الجانب الخلفي من غطاء أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 مل بواسطة شفرة حلاقة وقم بعمل "تاج". يستخدم هذا التاج لمنع انتشار أسمنت الأسنان إلى الجلد. ضعه على الجمجمة بحيث تظل ثقوب الأزيز التي تم إجراؤها في الخطوة 2.5 داخل الدائرة (انظر الشكل 1).
- قم بإعداد مجموعة تجسيمية عن طريق وضع قنية توجيه على الذراع الأقصر لمحول تجسيمي وربطها باستخدام صامولة غطاء. اضبط الذراع الأطول للمحول التجسيمي على مشبك القطب. قم بتثبيته على مناور الجهاز التجسيمي (انظر الشكل 1 أ).
- قم بتدوير مجموعة التجسيم الظهرية البطنية (D-V) على ذراع المناور بمقدار 12 درجة (انظر الشكل 1 ب). انقل قنية التوجيه إلى فتحة الأزيز المصنوعة في 1.6. أدخل قنية التوجيه ببطء في الدماغ عن طريق خفضها بمقدار 1.2 مم.
ملاحظه: زاوية المسبار خاصة بالحصين. قد تتطلب مناطق أخرى زوايا أخرى أو لا تتطلب أي زاوية على الإطلاق. استشر أطلس الدماغ للحصول على إحداثيات دقيقة. جفف سطح الجمجمة ، لأنه إذا لم يكن الأمر كذلك ، فلن يلتصق الأسمنت ويمكن أن ينفصل الغطاء الأسمنتي
- أضف أسمنت الأسنان داخل التاج لتغطية كل من الجزء المعدني من قنية التوجيه والمسمار العظمي بالكامل بما يكفي لتثبيتهما. ضع أسمنت أسنان إضافي إذا كان هناك جزء من الجمجمة مكشوفا.
- انتظر حتى يجف أسمنت الأسنان تماما (~ 12-20 دقيقة). قم بإزالة المحول التجسيمي من مشبك القطب. قم بإزالة صامولة الغطاء واستبدل المحول التجسيمي بمسبار وهمي واربط صامولة الغطاء.
- حرر الماوس من الجهاز التجسيمي ووضع الماوس بمفرده في قفص فردي.
ملاحظه: لا ينبغي ترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. افحص الماوس يوميا حتى يوم غسيل الكلى المجهري. يتلقى الفأر الأدوية غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAIDs) مثل الكاربروفين إذا بدا أنه يعاني من الألم. يعد الانتظار لمدة أسبوعين ضروريا لدراسات النوم والاستيقاظ حتى يعتاد الفأر على البيئة الجديدة ، ولكن قد تتطلب الأنواع الأخرى من الدراسات فترات تعافي أقصر (على سبيل المثال ، 1-2 أيام).
3. إعداد غسيل الكلى المجهري
- فحص جودة المجسات: املأ حقنة 1 مل يمكن التخلص منها بالماء المقطر وقم بتوصيلها بمخرج (منفذ أقصر) للمسبار باستخدام أنبوب بايتون. قم بتغطية فتحات التهوية بالأصابع واضغط على مكبس المحقنة برفق لنقع الماء في المسبار. تأكد من ظهور الماء من مدخل المسبار وعدم وجود تسرب على سطح غشاء غسيل الكلى المجهري.
- تنشيط المجسات: اغمر أغشية المسبار في الإيثانول (70-100٪) لمدة ثانيتين. ثم قم بنقع الماء المقطر في المسبار مرة أخرى باستخدام حقنة مرة أخرى.
- تحضير عازلة التروية: من أجل تجنب التصاق الجزيئات المستهدفة بالأنابيب ، أضف BSA عن طريق تخفيف محلول BSA بنسبة 30٪ إلى 4٪ بالسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF: 1.3 ملي CaCl2 ، 1.2 ملي مولار MgSO4 ، 3 ملي كتاسوتا ، 0.4 ملي هيلوتيم هيدروليت2PO4 ، 25 ملي NaHCO3 ، 122 ملي كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني = 7.35) ، والذي يتطابق بشكل وثيق مع تركيز الإلكتروليت في السائل الدماغي النخاعي ، مباشرة قبل الاستخدام. قم بتصفية المخزن المؤقت للتروية من خلال وحدة مرشح حقنة بحجم مسام 0.1 ميكرومتر.
ملاحظة: يعمل ألبومين مصل الأبقار بنسبة 4٪ (BSA) على تحسين التعافي من البروتينات اللاصقة ولكن يمكن أن يحد بشدة من توصيل المركبات ، خاصة بالنسبة للمركبات التي تحتوي على ارتباط عالي ب BSA. هذه إحدى مزايا استخدام تركيز أقل من BSA (مثل 0.15٪) في حالات معينة. لاحظ أن BSA يمكن أن يتجمع بسهولة شديدة عند تحريكه بواسطة دوامة أو لوحة تحريك. يمكن أن تسد هذه الركام المجسات أو المسام الغشائية. توخي الحذر عند إعداد حل BSA للحد من هذا التجميع
- قم بإعداد خطين منفصلين للمدخل والمخرج (انظر الشكل 1C) وقم بتوصيل كلا الخطين بإبرة توصيل. املأ حقنة 3 مل يمكن التخلص منها مملوءة بمخزن التروية وقم بتوصيلها بنهاية مدخل الأنبوب باستخدام إبرة غير حادة. املأ الأنبوب بالكامل بمخزن مؤقت للتروية عن طريق تشغيل مضخة الحقنة.
- أوقف مضخة الحقنة واستبدل إبرة التوصيل بين خط المدخل وخط المخرج بمسبار غسيل الكلى المجهري المنشط من الخطوة 3.3 (انظر الشكل 1C). قبل هذا الاستبدال ، ضع صامولة الغطاء على المسبار.
- قم بتركيب أنبوب الأسطوانة في أنبوب المخرج على مضخة الأسطوانة. ابدأ تشغيل مضخة الحقنة عند 10 ميكرولتر / دقيقة ثم المضخة الدوارة بمعدل تدفق أبطأ قليلا (9.5-9.8 ميكرولتر / دقيقة). تأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء في الأنبوب بأكمله ، مما قد يؤثر على التعافي عند دخولها المسبار.
- قم بتخدير الماوس من الخطوة 1.12 بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.2. ضع طوق الماوس حول رقبته. قم بإزالة صامولة الغطاء والمسبار الوهمي وأدخل مسبار غسيل الكلى المجهري ببطء من 3.4 من خلال قنية التوجيه واربط صامولة الغطاء.
- ضع الماوس في القفص المتصل بنظام حر الحركة وربط الماوس بالياقة. استمر في تشغيل كل من مضخة الحقنة والمضخة الدوارة بمعدل التدفق المشار إليه في الخطوة 3.5 لمدة 1 ساعة على الأقل < br / >
ملاحظه: لتحقيق جمع ISF من المستيقظة ، تستخدم هذه المقالة نظاما حر الحركة ، حيث يستجيب القفص نفسه لحركة لمنع الأنابيب من الالتواء. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام دوارات سائلة متوفرة من شركات مختلفة.
- أوقف مضخة الأسطوانة أولا ثم مضخة المحقنة. اضبط معدل التدفق المطلوب. قم بتشغيل مضخة الحقنة بنسبة 20٪ أسرع من مضخة الأسطوانة.
ملاحظه: على سبيل المثال ، إذا كنت تعمل بسرعة 1 ميكرولتر / دقيقة ، فقم بتشغيل مضخة الحقنة بسرعة 1.2 ميكرولتر / دقيقة. يجب تحديد معدل التدفق الأمثل تجريبيا لكل جزيء.
- جمع عينات ISF: ضع الطرف الحر لأنبوب المخرج على مجمع الكسر المبرد.
ملاحظه: يختلف حجم العينة المناسب اعتمادا على المقايسات المستخدمة في التحليل.
- بعد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة المسبار. (قم بتخدير الماوس حسب الحاجة.)تعامل مع استرداد الماوس بنفس الطريقة كما في الخطوة 2.11. تحليل ISF الذي تم جمعه بطرق مثل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) أو مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
- لغسل الأنبوب بالكامل بعد غسيل الكلى المجهري ، قم بتوصيل أنابيب المدخل والمخرج مرة أخرى عن طريق استبدال المسبار بإبرة التوصيل وتشغيل المبيض المخفف في الأنبوب بأكمله ثم غسله بالماء. جففه وتخزينه للاستخدام المتكرر.
ملاحظه: أنواع أخرى من الأنابيب مقبولة ، ومع ذلك ، يمكن أن يسد BSA في عازلة التروية الأنابيب ذات القطر الصغير ، وبالتالي تعتبر هذه الأنابيب للاستخدام الفردي. يمكن أن تتآكل الأنابيب أو تسدها بعد استخدامات متعددة ، لذا تأكد من أن معدل التدفق ثابت في كل مرة قبل الاستخدام.
