نموذج غزو الورم القائم على المصفوفة باستخدام الزراعة المشتركة للورم الأرومي الدبقي الدبقي

الملخص

المصدر: Coniglio، S.، et al. فحوصات الزراعة المشتركة لدراسة تحفيز البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة لغزو الورم الأرومي الدبقي. J. Vis. Exp. (2016)

في هذا الفيديو، يتم خلط خلايا الورم الأرومي الدبقي والخلايا الدبقية الصغيرة بمحلول مصفوفة بوليمر ونقلها إلى غرفة مسامية حيث يتشكل هلام، مما يؤدي إلى تضمين الخلايا. تحفز الخلايا الدبقية الصغيرة هجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي من خلال الإدخال المسامي ، وتحاكي غزو الخلايا السرطانية إلى الأنسجة المحيطة ، ثم يتم إصلاح الخلايا وإعدادها لمزيد من التحليل.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. وضع العلامات الفلورية على الخلايا

< p class = "jove_content" >ملاحظة: قم بتسمية خطوط خلايا الورم الأرومي الدبقي والخلايا الدبقية الصغيرة بأصباغ الفلورسنت 9. بدلا من ذلك ، قم بإنشاء خطوط خلوية تعبر بشكل أساسي عن بروتينات الفلورسنت مثل GFP / RFP.

1. خلايا الألواح على صفيحة 6 آبار بحيث تكون 70-80٪ ملتقية في يوم تلطيخها. بالنسبة لخط خلايا الورم الأرومي الدبقي في الفئران GL261 وخط خلية الورم الأرومي الدبقي البشري U87 ، اللوحة 1 × 10⁶ و 1.5 × 10⁶ خلايا ، على التوالي ، على طبق 6 سم قبل 24 ساعة من التلوين.
2. قم بإعداد محلول صبغة صبغة الخلايا الفلورية في DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) وأضف صبغة 5 ميكرومتر إلى الوسائط ، إما وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) أو متوسط مصل البلاعم الخالي من البلاعم (MSFM) ، بئر دوامة.
3. احتضان الخلايا بالصبغة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
4. قم بإزالة الوسائط المحتوية على الصبغة وإضافة وسائط جديدة (RPMI أو MSFM) إلى الخلايا.
5. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: الخلايا ملطخة الآن وجاهزة للاستخدام في التجربة.

< p class = "jove_title" >2. فحص الغزو "3D" - تضمين الورم الدبقي والبلاعم / الخلايا الدبقية الصغيرة في المصفوفة

1. قم بإذابة الجليد في مزيج المصفوفة عند 4 درجات مئوية طوال الليل. قم بإجراء جميع عمليات التلاعب الإضافية باستخدام مصفوفة على الجليد في الغطاء.
2. تحضير تركيز 10 مجم / مل من المصفوفة في الوسائط (MSFM أو RPMI) مع 0.3٪ BSA على الثلج.
   ملاحظه: عادة ما يكون تركيز مخزون المصفوفة حوالي 15 مجم / مل.
3. لتحضير الخلايا (الموضحة في الخطوة 1) للتعليق في المصفوفة ، قم بإزالة الوسائط من الخلايا عن طريق الشفط. اغسل الخلايا على طبق يحتوي على 2 ملي مولار EDTA (حمض إيثيلين ديامين تتراأسيتيك) / PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات). أضف 500 ميكرولتر من 2 ملي مولار EDTA / PBS إلى الخلايا واحتضانها لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
4. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من الوسائط التي تحتوي على 0.3٪ BSA.
5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 120 × جم.
6. استنشق المادة الطافية من الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في الوسائط / 0.3٪ BSA بحيث يكون تركيز الخلايا مساويا ل 1 × 10⁶ خلايا / مل. استخدم مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا.
7. أضف 1.5 × 10⁵ خلايا GL261 (في 150 ميكرولتر) + 5 × 10⁴ خلايا دبقية صغيرة (في 50 ميكرولتر) في أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 مل. أضف 2 × 10⁵ خلايا GL261 (200 ميكرولتر) في أنبوب دقيق منفصل سعة 1.5 مل.
   ملاحظه: تعمل خلايا GL261 وحدها بدون الخلايا الدبقية الصغيرة كعنصر تحكم.
8. قم بتدوير الخلايا في جهاز ميكرو فوج لمدة 5 دقائق عند 120 × جم.
9. أعد تعليق الخلايا في مصفوفة باردة سعة 200 ميكرولتر على الجليد.
10. لوحة 50 ميكرولتر (50,000 خلية) في وسط المقصورة العلوية لإدراج الغرفة بحجم المسام 8 ميكرومتر.
11. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى تحدث البلمرة.
12. أضف 200 ميكرولتر وسط خال من المصل إلى الحجرة العلوية و 700 ميكرولتر من وسط نمو الخلايا المحتوي على المصل إلى البئر السفلي.
13. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 48 ساعة.
14. بعد الحضانة ، قم بإزالة الخلايا من أعلى الغرفة عن طريق الشفط اللطيف وإصلاح الغرف عن طريق وضعها في 3.7٪ فورمالديهايد في PBS. اترك الغرف تبقى في المثبت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية). قم بإزالة المثبت عن طريق الشفط اللطيف واستبدله ب 500 ميكرولتر 1x PBS. انتقل إلى القسم 4 لتحليل الصور.

النتائج

الشكل 1: تخطيطي لبروتوكولين مختلفين لفحص غزو خلايا الخلايا الدبقية الصغيرة / البلاعم المحفز بالبلاعم. توضح اللوحة العلوية مقايسة غزو غرفة المصفوفة المطلية مسبقا. توضح اللوحة السفلية مقايسة غزو المصفوفة ثلاثية الأبعاد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
غرفة غزو Corning BioCoat Matrigel: مع مصفوفة BD Matrigel	كورنينج / فيشر العلمي	القط: 354481
البلاعم مصل خالية من الوسائط (MSFM) (500 مل)	تقنيات الحياة	12065-074
صبغة CellTracker CMTPX أحمر	تقنيات الحياة / المجسات الجزيئية	C34552
صبغة CMFDA الخضراء CellTracker	تقنيات الحياة / المجسات الجزيئية	C2925
خط خلية GL261	المعهد الوطني للسرطان (NCI)
خط خلية THP-1	مجموعة ثقافة نوع الأنسجة الأمريكية	ATCC TIB-202
RPMI 1640 متوسط (500 مل)	لايف تكنولوجيز / جيبكو	11875-093
محلول الفورمالديهايد	سيجما ألدريتش	F1635
إدراج ثقافة الخلايا الغشائية من البولي كربونات Corning Transwell (8 ميكرومتر المسام) 48 لكل عبوة.	كورنينج	CLS3422
مصفوفة ثقافة Cultrex 3-D مخفضة عامل النمو مستخلص الغشاء القاعدي ، PathClear	Trevigen	3445-005-01
مصل ربلة الساق الجنينية (FBS)	تقنيات الحياة	القط: 10500064
ألبومين مصل الأبقار ، الجزء الخامس ، علاج الصدمة الحرارية	علم السمك	BP1600-100
0.5 مليون EDTA	ثيرموفيشر العلمي	15575-020