مقالة منهجية

دراسة انتقال الخلايا الليمفاوية عبر طبقة أحادية للخلايا البطانية الوعائية الدقيقة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Schulte-Mecklenbeck، A.، et al.، تحليل تسرب الخلايا الليمفاوية باستخدام نموذج في المختبر لحاجز الدم البشري في الدماغ. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تحقيقا تجريبيا لانتقال الخلايا الليمفاوية عبر نموذج بطانة الحاجز الدموي الدماغي (BBB). يتم إنشاء طبقة أحادية من الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري (HBMECs) في المختبر ، وتضاف خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية إلى الطبقة الأحادية. ثم يتم تحضين الخلايا للسماح بانتقال الخلايا الليمفاوية ، ويتم قياس الخلايا المهاجرة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحضير إدراج ثقافة الخلية

  1. طلاء إدراج زراعة الخلايا
    ملاحظة مهمة: تجنب لمس غشاء إدخالات زراعة الخلايا.
    1. أضف 100 ميكرولتر من محلول الفيبرونيكتين إلى كل إدراج لزراعة الخلايا (الشكل 1 أ) وبئر واحد من لوحة سفلية مسطحة مكونة من 96 بئرا (بئر تحكم بصري). احتضان لمدة 3 ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة شفط محلول الفبرونيكتين.
    2. أضف 100 ميكرولتر من تعليق HBMEC إلى إدخالات ثقافة الخلايا وبئر التحكم البصري. أضف 600 ميكرولتر متوسط القاعدية المتوسطة (ECM-b) إلى الحجرة السفلية من إدخالات ثقافة الخلايا. احتضان لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى يتم الوصول إلى سلامة الحاجز (الشكل 1 ب) ، وتحقق من نمو الخلية عن طريق التقييم المجهري ل HBMEC في بئر التحكم البصري.
      ملاحظه: لا ينصح بنمو الخلايا بعد أربعة أيام.

2. مقايسة الترحيل

  1. تحضير خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC).
    1. أضف 10 مل وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وأضف 200 ميكرولتر من مكمل B27. عد خلايا PBMC وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق PBMC إلى تركيز نهائي قدره 5 × 106 خلايا/مل RPMI/B27.
  2. إعداد مقايسة الترحيل
    1. وسط الشفط من المقصورة السفلية متبوعا بالمقصورة العلوية لإدخالات ثقافة الخلايا التي تحتوي على طبقات أحادية HBMEC ملتقية (الشكل 1 أ). لكل متبرع ، أضف 100 ميكرولتر من معلق PBMC لكل من إدخالات زراعة الخلايا وأيضا إلى بئر واحد من لوحة 24 بئرا لكل (التحكم في المختبر).
    2. أضف 600 ميكرولتر RPMI / B27 إلى الحجرة السفلية لإدخالات ثقافة الخلايا و 500 ميكرولتر إلى PBMC للتحكم في المختبر واحتضان 6 ساعات عند 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  3. حصاد PBMC المهاجر
    1. أخرج حشوة مزرعة الخلايا باستخدام ملقط واشطف الجزء السفلي بعناية باستخدام 400 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) دون لمس الغشاء. تخلص من ملحق زراعة الخلايا.
    2. أضف 20 ميكرولتر من الغلاف الفلوري لعدد التدفق (حوالي 1,000 حبة / ميكرولتر) إلى المقصورة السفلية من إدراج ثقافة الخلية وكذلك إلى التحكم في المختبر واخلطها جيدا. انقل 1 مل من تعليق PBMC الناتج إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي.
فئة

3. قياس التدفق الخلوي

  1. تحضير العينة
    1. جهاز الطرد المركزي PBMC عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة عن طريق إضافة الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم إلى المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي 100 ميكرولتر (PBS / 1٪ ألبومين مصل بقري [BSA] / 2 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك [EDTA]) لكل عينة. بالنسبة للنتائج المعروضة أدناه ، تم استخدام 1 ميكرولتر CD4-FITC (مجموعة تمايز 4-فلوريسين إيزوثيوسيانات) ، 1 ميكرولتر CD3-PerCP / Cy5.5 (بروتين كلوروفيل البيريكينين / السيانين 5. 5) ، 1 ميكرولتر CD56-PC7 (سيانين فيكوريثرن 7) ، 1 ميكرولتر CD8-A700 (أليكسا فلور 700) ، و 1 ميكرولتر CD16-A750 (أليكسا فلور 750) ، لكل عينة.
    3. أعد تعليق PBMC في 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    4. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: الهجرة التفاضلية للمجموعات الفرعية لخلايا NK عبر الطبقات الأحادية HBMEC غير الملتهبة والملتهبة. أ. صورة لإدخالات الخطوط العريضة (يسار) ورسم توضيحي للإعداد التجريبي (يمين). ب. التحقق من صحة وظائف حاجز HBMEC. إلى اليسار: تلطيخ كيميائي مناعي لجزيء الوصلة الضيقة ZO-1 باستخدام الأرانب المضادة للإنسان zonula occludens-1 (ZO-1 ، abcam ، 1: 200) والغلوبولين المناعي للماعز المضاد لل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
برنامج تلفزيونيجيبكو14190-094بدون CaCl2 أو MgCl2
فيبرونيكتين 1 مجم / مل سيجماF1141-5MG من بلازما البقر
HBMECScienCell 1000
HBMECبيلوبيوتيكPB-H-6023
ECM-bScienCell1001-ب
FBSScienCell1001-ب
البنسلين / الستربتومايسين ScienCell1001-ب
مكمل نمو الخلايا البطانية ScienCell1001-ب
ترانسويلكورنينج3472 واضح ، قطر 6.5 مم ، حجم المسام 3.0 ميكرومتر
96 بئر صفيحة سفلية مسطحةكورنينج3596
B27جيبكو17504-044 50 ضعفا مركزا
لوحة 48 بئركورنينج3526
RPMI 1640جيبكو61870-010
عدد التدفقات الفلوروسفير بيكمان كولتر7547053
Na-EDTAسيجماE5134
BSAسيجماA2153
CD3-PerCP/Cy5.5الأسطورة الحيوية300430 استنساخ UCHT1
CD56-PC7بيكمان كولترA21692 استنساخ N901
CD16-A750بيكمان كولترA66330 استنساخ 3G8
CD4-FITCأسطورة حيوية300506 استنساخ RPA-T4
CD8-A700بيكمان كولترA66332 استنساخ B9.11

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Transwell

مقالات ذات صلة