قياس منطقة الاحتشاء ووذمة الدماغ في دماغ الفئران بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط

الملخص

المصدر: فرانك ، د. ، وآخرون قياس الوذمة الدماغية بعد السكتة الدماغية ومنطقة الاحتشاء وانهيار الحاجز الدموي الدماغي في مجموعة واحدة من عينات دماغ القوارض. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو تقييم منطقة الاحتشاء ووذمة الدماغ في شرائح الدماغ من الفئران المعرضة لانسداد الشريان الدماغي الأوسط. يتم تحديد المناطق المحتضنة باستخدام تلطيخ الأكسدة والاختزال ، بينما تحدد وظيفة المرشح الأزرق والعتبة في برنامج تحليل الصور منطقة الاحتشاء والوذمة في نصف الكرة المصاب.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

< p class = "jove_title" >1. تحديد منطقة الاحتشاء

1. قم بقياس منطقة الاحتشاء (IZ) بعد 24 ساعة من انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO).
   ملاحظه: يتم استبعاد الفئران التي فقدت أكثر من 20٪ من وزنها أو أصيبت بنوبات أو شلل نصفي من التجربة.
2. قتل الفئران عن طريق استبدال خليط الغاز المستوحى ب 20٪ أكسجين و 80٪ ثاني أكسيد الكربون حتى يتوقف الجرذ عن التنفس تلقائيا.
3. افتح الصدر بشق جانبي 5-6 سم عبر جدار البطن أسفل القفص الصدري باستخدام المقص والملقط الجراحي.
4. قم بإجراء شق في الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري بالكامل باستخدام المقص والملقط الجراحي.
5. قم بإزاحة الرئتين بعناية ، وقطع القفص الصدري حتى عظمة الترقوة على الجانبين الأيمن والأيسر.
6. يمرر ب 200 مل من المحلول الملحي العادي من خلال البطين الأيسر للقلب.
7. ثقب أو شق الأذين الأيمن للقلب بالمقص.
8. قم بقطع الرأس باستخدام المقصلة وجمع أنسجة المخ.
9. باستخدام مقص القزحية ، قم بقص الثقبة إلى الحافة البعيدة لسطح الجمجمة الخلفي على كلا الجانبين.
10. افصل البصيلات الشمية والوصلات العصبية على طول السطح البطني والسطح الظهري للجمجمة عن الدماغ.
11. إزالة الدماغ من الرأس.
12. أنتج 6 شرائح دماغية عن طريق إنشاء أقسام أفقية بسمك 2 مم بشفرة حلاقة من الفولاذ المقاوم للصدأ .009 بوصة ، غير مطلية ، ذات حافة واحدة.
13. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بنسبة 0.05٪ TTC.
14. ضع أنسجة المخ على شرائح المجهر وقم بإجراء مسح ضوئي لهذه الشرائح الدماغية الستة بدقة 1600 × 1600 نقطة في البوصة (انظر الشكل 1 على سبيل المثال).
15. أضف مرشحا أزرق باستخدام محرر صور (على سبيل المثال، Adobe Photoshop CS2) باستخدام وظيفة Channel Mixer (تعديلات > الصورة > Channel Mixer) واحفظ الصورة بتنسيق ملف JPEG.
    >ملاحظه: بعد تطبيق المرشح الأزرق ، ستظهر الصورة بتدرج الرمادي.
16. افتح الصورة المحفوظة في ImageJ 1.37v.
    ملاحظه: يستخدم برنامج الكمبيوتر هذا وظيفة عتبة لعزل وحساب وحدات البكسل إما بالأبيض أو الأسود (انظر الشكل 2).
17. لكل شريحة من شرائح الدماغ الستة للصورة ، حدد واحفظ كل نصف كرة أرضية (اليمين المصاب المماثل واليسار غير المصاب) كملف صورة منفصل باستخدام أداة "اختيار المضلع" من القائمة الرئيسية.
18. قم بتعيين الحد الأقصى لتحديد المنطقة الصناعية باستخدام وظيفة العتبة التلقائية من القائمة الرئيسية لبرنامج ImageJ عن طريق تحديد Image > ضبط > Threshold وقياس عدد وحدات البكسل في كل نصف كرة من مجموعة دماغية واحدة.
    >ملاحظه: يمكن استخدام وحدات الماكرو لهذه الخطوة في برنامج ImageJ (انظر المستند التكميلي 1 للحصول على التعليمات البرمجية). يعد القطع معلمة مهمة لتحديد وحدات البكسل التي يجب تحويلها إلى اللون الأبيض وأيها يجب تحويلها إلى اللون الأسود اعتمادا على ظل اللون الرمادي (انظر الشكل 3 والشكل 4 كأمثلة). ثم يقارن ImageJ وحدات البكسل البيضاء والسوداء لتحديد IZ. استنادا إلى بروتوكول التلوين وإعدادات الماسح الضوئي ، استخدمنا قيمة قطع ثابتة تبلغ 0.220.
19. قم بإجراء قياس تصحيح IZ لتورم الأنسجة باستخدام طريقة نسب نصفي الكرة المخية المتماثلة والمقابلة (RICH) (انظر المثال في الشكل 5).
    
    ملاحظه: يتم تقييم حجم الاحتشاء كنسبة مئوية من نصف الكرة المقابل.

< p class = "jove_title" >2. تحديد وذمة الدماغ

ملاحظة: استخدم ImageJ 1.37v لقياس وذمة الدماغ (BE).

1. قم بقياس BE بعد 24 ساعة من MCAO. لحساب BE ، استخدم البيانات من حجم نصف الكرة الأيسر والأيمن (بالوحدات).
2. قم بإجراء مسح ضوئي بدقة 1600 × 1600 نقطة في البوصة (انظر الشكل 1 على سبيل المثال).
3. حدد نصفي الكرة المخية وقم بتعيين الحد الأقصى لتحديد BE باستخدام ImageJ 1.37v ، كما هو موضح أعلاه في الأقسام 1.17-1.19.
4. عبر عن مساحة BE كنسبة مئوية من المساحات القياسية لنصف الكرة المقابل غير المتأثر ، محسوبة بطريقة RICH باستخدام المعادلة التالية (انظر المثال في الشكل 5).
   
   ملاحظه: يتم تقييم مدى BE كنسبة مئوية من نصف الكرة المقابل.

النتائج

الشكل 1: مثال على مسح شرائح الدماغ.

الشكل 2: شرائح الدماغ التمثيلية للفئران التي تعمل بالزائف والفئران MCAO.

(أ-ب) الصورة الأصلية الممسوحة ضوئيا. (C-D) التحول إلى تدرج الرمادي. (E-G) وظيفة العتبة. (جي ح) تطبيق مرشح أزرق....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مصفوفات الدماغ والأنسجة	سيجما ألدريتش	15013
الماسح الضوئي	Canon	Cano Scan 4200F	الدقة 3200 × 6400 نقطة في البوصة
أطباق بتري	سيجما ألدريتش	P5606
شفرات مشرط #11	سيجما ألدريتش	S2771
البرمجيات
Adobe Photoshop CS2 لنظام التشغيل Windows	أدوبي
ImageJ 1.37v	المعاهد الوطنية للصحة		شفرة المصدر متاحة مجانا. المؤلف ، واين راسباند (wayne@codon.nih.gov) ، يعمل في فرع خدمات البحوث ، المعهد الوطني للصحة العقلية ، بيثيسدا ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية
Office 365 ProPlus	مايكروسوفت	-	مايكروسوفت أوفيس إكسل
ويندوز 10	مايكروسوفت
الكواشف
2،3،5-كلوريد ثلاثي الفينيلترازوليوم	سيجما ألدريتش	298-96-4
إيفانز الأزرق 2٪	سيجما ألدريتش	314-13-6