تقييم المقاومة الكهربائية عبر البطانة في نموذج الحاجز الدموي الدماغي في المختبر

الملخص

المصدر: Kuzmanov, I., et al. نموذج للحاجز الدموي الدماغي باستخدام التحليل الطيفي للمقاومة: التركيز على تفاعل الخلايا التائية والخلايا البطانية. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتقييم المقاومة الكهربائية عبر البطانة (TEER) في الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ الفئران في المختبر. تشير قيمة TEER العالية إلى تقاطعات الخلايا البطانية السليمة ، بينما تؤدي إضافة الخلايا التائية المنشطة إلى تقليل قيمة TEER ، مما يعكس تعطيل حاجز الوصلات.

البروتوكول

1. إعداد وإجراء قياس المقاومة الكهربائية عبر البطانة (TEER)

1. ضع الوحدة المكونة من 24 بئرا لأداة المقاومة الكهربائية عبر البطانة (TEER) أسفل غطاء التدفق الرقائقي. قم بإزالة الأغطية ووضع الإدخالات مع الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة لدماغ الفأر (MBMECs) في الجهاز باستخدام الملقط.
2. ماصة 810 ميكرولتر من الوسط الطازج إلى المقصورة السفلية لآبار الوحدة: أضفها بعناية بين الملحق وجدار البئر النوحية.
3. أغلق الأغطية وضع الأداة في الحاضنة. قم بتوصيل الجهاز بجهاز الكمبيوتر الخاص به ؛ قم بتشغيل وحدة التحكم في العدادات وافتح البرنامج.
4. حدد "قياس جديد" في النافذة المنبثقة. حدد مربعي "show TEER" و "show Ccl" ؛ ثم اضغط على "ابدأ". بعد الانتهاء من القياس الأول ، حدد "التحقق من جميع الآبار" في علامة التبويب "النتائج" لرؤية جميع قيم TEER وسعة طبقة الخلية (Ccl).
5. احفظ الملف: ملف>حفظ باسم> اسم ملفك".
   ملاحظة: نظرا لأن TEER و Ccl يتم قياسهما بشكل مستمر بطريقة آلية ، راقب قيمهما على مدى ثلاثة إلى خمسة أيام. تغيير الوسيط ليس ضروريا ما لم تكن صلاحية الخلية دون المستوى الأمثل ، كما يتضح من عدم وجود زيادة في TEER.
6. اختر النقطة الزمنية للزراعة المشتركة ل MBMECs مع الخلايا التائية عندما يكون Ccl مستقرا وأقل من 1 μF / cm ² ووصل TEER إلى الحد الأقصى لمستواه.
7. افحص بعناية قيم TEER و Ccl المطلقة واستبعد الآبار التي لم تطور فيها MBMECs طبقات أحادية متجانسة بما فيه الكفاية عن طريق فك تحديد هذه الآبار.
8. قم بتجميع باقي الآبار: انقر بزر الماوس الأيمن على بئر وحدد "إضافة بئر إلى بئر متوسط جديد". قم بتسميته في النافذة المنبثقة ؛ افعل الشيء نفسه لجميع الآبار الفردية التي سيتم تجميعها.
9. تحقق من جميع الآبار المتوسطة للتأكد من أن جميعها لها نفس الظروف الأولية قبل الزراعة المشتركة. إذا كان بعضها يحتوي على قيم TEER المطلقة أو منحدرات TEER مختلفة بشكل كبير ، أو كانت الأخطاء القياسية كبيرة جدا ، فأعد التجميع.
   ملاحظة: يوفر التجميع الأمثل للآبار الحد الأدنى من التباين في قيم TEER داخل المجموعات التجريبية وفيما بينها.
10. في علامة التبويب "التجربة" ، اضغط على "إيقاف مؤقت" ، وافصل الجهاز وأخرجه من الحاضنة. قم بإزالة الأغطية الموجودة أسفل غطاء التدفق الرقائقي.
11. قم بإعداد الخلايا التائية المنشطة مسبقا و / أو الساذجة ، مع أو بدون سيتوكينات أو أجسام مضادة أو مواد أخرى محددة ، حسب الرغبة. على سبيل المثال ، امزج الجسم المضاد للفئران الأصلي / منخفض السموم الداخلية (NA / LE) المضاد للفأر (IFN-γ) (استنساخ XGM1.2) مع الخلايا التائية المحضرة عند 20 ميكروغرام / مل لكل بئر من أداة TEER.
    ملاحظة: إذا تم استخدام مواد مثل مثبط الجرانزيم B ، يتم إضافتها إلى ثقافة الخلايا التائية في بداية تحفيز الخلايا التائية: على سبيل المثال ، يتم خلط مثبط Granzyme B II (Calbiochem) مع الخلايا التائية المعزولة بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
12. قم بإزالة بعض الوسائط من الملحق (حجرة البئر العلوية). مثال: قم بإخراج 150 ميكرولتر بعناية (يجب تجنب إزالة كل الوسيط لأنه قد يزعج الطبقة الأحادية MBMEC).
13. أضف الخلايا التائية إلى MBMECs عن طريق سحب 150 ميكرولتر من الوسط بعناية يحتوي على 2 × 10 ⁵ خلايا / إدراج.
    ملاحظة: عند حصاد الخلايا التائية التي تم تنشيطها مسبقا ، عد فقط تفجير خلايا Trypan Blue الخالية من الأزرق.
14. أغلق الأغطية وضع الأداة مرة أخرى في الحاضنة. أعد توصيل الجهاز واضغط على "استئناف القياس". بعد 24 ساعة ، اضغط على "إيقاف" في علامة التبويب "تجربة" واحفظ الملف (ملف>حفظ).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	بما في ذلك: وحدة خلية 24 بئر ، وحدة تحكم ، كمبيوتر مع برنامج cellZscope v2.2.2
إدراج غشاء Transwell - حجم المسام 0.4 ميكرومتر	كورنينج	3470	لقياس TEER كقراءة رئيسية
إدراج غشاء Transwell - حجم المسام 3 ميكرومتر	كورنينج	3472	لقياس TEER كمراقبة الجودة قبل مقايسة انتقال الخلايا التائية
لوحة زراعة الخلايا 24 بئر	Greiner	650 180	قاع مسطح. لثقافة MBMEC
لوحة زراعة خلايا 96 بئر	كوستار	3526	أسفل مستدير. لزراعة الخلايا المناعية
غرفة عد نيوباور	مارينفيلد	MF-0640010	لعد الخلايا
الكولاجين من النوع الرابع من المشيمة البشرية	سيجما	C5533	لحل طلاء MBMEC
الفيبرونيكتين من بلازما الأبقار	سيجما	F1141-5MG	لحل طلاء MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)	جيبكو	31966-021	لعزل MBMEC ووسيط ثقافة MBMEC
البنسلين / الستربتومايسين	سيجما	P4333	لعزل MBMEC ووسيط ثقافة MBMEC
الهيبارين	سيجما	H3393	لوسيط ثقافة MBMEC
عامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسي (bFGF)	PeproTech	100-18B	لوسيط ثقافة MBMEC
IMDM + 1٪ L-Glutamin	جيبكو	21980-032	لوسط زراعة الخلايا التائية
الفئران المؤتلف IFN-γ	PeproTech	315-05	لمقايسات نقل الخلايا التائية
المؤتلف الفئران TNF-α	PeproTech	315-01A	لمقايسات نقل الخلايا التائية
NA / LE منقى IFN-γ المضاد للفأر	BD العلوم البيولوجية	554408	استنساخ XMG1.2; التركيز النهائي الموصى به: 20 ميكروغرام / مل
مثبط Granzyme B II	كالبيوكيم	368055	التركيز النهائي الموصى به: 10 ميكرومولار
الجسم المضاد ل CD4 المضاد للفأر PE	أسطورة حيوية	116005	استنساخ RM4-4 ؛ لتحليل انتقال الخلايا التائية
محلول تريبان بلو ، 0.4٪	ثيرمو فيشر العلمي	15250061	لعد الخلايا