تلطيخ كيميائي مناعي للألياف العصبية في النواة القاعدية لماينر في دماغ الفأر

الملخص

المصدر: سينغ ، ب. ، وآخرون . التقدير التجميدي لطول الألياف الكولينية في النواة القاعدية من Meynert من دماغ الفأر. J. Vis. exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو التلوين الكيميائي المناعي للألياف الكولينية في النواة القاعدية لمنطقة ماينرت من أقسام دماغ الفئران. يتم حظر الأقسام ومعالجتها بأولي ضد أسيتيل ترانسفيراز الكولين, تليها الأجسام المضادة الثانوية البيوتينيل. تضاف مجمعات أفيدين-بيوتين-بيروكسيداز ، والتي ترتبط بالأجسام المضادة الثانوية ، تليها الركيزة الملونة. ثم يتم تجفيف الأقسام وتركيبها قبل تصورها تحت المجهر.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية الحيوانية المناسبة.

فئة

1. التروية ومعالجة الأنسجة

1. تخدير الفئران باستخدام حقن داخل الصفاق مع الكيتامين (100 مجم / كغ) وزيلازين (10 مجم / كغ). اضغط على أصابع القدم لتأكيد عدم الاستجابة قبل المتابعة.
2. perfuse عبر القلب مع ~ 50 مل من محلول ملحي Dulbecco البارد بالماء الملحي المخزن بالفوسفات (DPBS) متبوعا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 0.1M عازلة فوسفات (PB).
   تحذير: PFA سام. استخدم معدات الحماية الشخصية (PPE) عند العمل مع PFA.
3. قم بإزالة الأدمغة واغمرها في 4٪ PFA في 0.1 M PB عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة للتثبيت اللاحق. يغسل باستخدام DPBS 3x.
4. قم بالتغيير إلى محلول سكروز بنسبة 15٪ في 0.1 DPBS بين عشية وضحاها ثم محلول سكروز بنسبة 30٪ في 0.1 M DPBS لمدة 48 ساعة أخرى عند 4 درجات مئوية.
5. قم بإزالة الأنسجة من محلول السكروز وقم بتجميدها في غرفة التبريد المحددة مسبقا على درجة حرارة -20 درجة مئوية. يمكن تخزين العينات المجمدة في أنابيب محكمة الغلق عند -80 درجة مئوية حتى التقسيم.
6. قم بتضمين الأنسجة في وسط تضمين درجة حرارة القطع المثلى (انظر جدول المواد) وتركيبها على قرص عينة. قم بقص الأقسام التسلسلية بسمك 30 ميكرومتر في مستوى إكليلي باستخدام التبريد وجمع جميع الأقسام وبالتالي في 24 لوحة ثقافة بئر مملوءة بمحلول الحماج بالتبريد (30٪ جلسرين ، 30٪ إيثيلين جلايكول ، 40٪ DPBS ؛ الشكل 1 أ - ج). يحفظ في فريزر -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: يفضل استخدام المقاطع السميكة (على سبيل المثال ، 50 ميكرومتر) عندما يكون ذلك ممكنا. تأكد من الحفاظ على الأقسام بترتيب القطع وأن جميع الأقسام في محلول تجميد تماما. يمكن استخدام صفيحة 96 بئرا كبديل ل 24 لوحة بئر لجمع الأقسام.
7. قم بتغطية الآبار بمادة مانعة للتسرب لمنع التبخر والتجفيف. قم بتخزين الأطباق في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر. الأقسام المخزنة عند -20 درجة مئوية مستقرة لعدة أشهر لكولين أسيتيل ترانسفيراز (ChAT) الكيمياء المناعية.

2. اختيار القسم المنهجي ل IHC

ملاحظة: يجب إجراء دراسة تجريبية لمعرفة العدد الإجمالي للأقسام المطلوبة لتحقيق معامل خطأ مقبول (CE). قيمة CE هي تعبير عن المقدار الإجمالي للخطأ في إجراء أخذ العينات. تمثل القيمة الأدنى الحد الأدنى للخطأ ، وتعتبر قيمة CE أقل من 0.1 مقبولة من قبل البرنامج المستخدم هنا (انظر جدول المواد).

1. حدد القسمين الأول والأخير لكل دماغ من خلال مقارنة السمات المورفولوجية بأطلس دماغ الفأر القياسي مثل فرانكلين وباكسينوس. تبدأ النواة القاعدية ل Meynert أو NBM عند bregma -0.0 مم وتنتهي عند -1.6 مم. لذلك ، يحتوي حوالي 50 قسما على NBM. العدد الإجمالي للأقسام هو أحد المعلمات المطلوبة أثناء علم الاسترقام. أعطى اختيار كل قسم 8 (SSF = 1/8) ما مجموعه 6-7 أقسام للتحليل وأسفر عن CE مقبول لكل من تقدير الحجم وتقدير طول الألياف في دراستنا التجريبية.
2. ابدأ بشكل عشوائي بأحد الأقسام الثمانية الأولى ثم قم بأخذ عينات منهجية من كل قسم 8 حتى آخر قسم خلفي يحتوي على NBM (الشكل 1 ج).

< ص الفئة = "jove_title" >3. الكيمياء المناعية

1. انقل الأقسام المحفوظة بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة في محلول التجلي بالتبريد ثم 0.1 متر من المخزن المؤقت للفوسفات (PB) في 6 ألواح آبار.
2. اغسل 3x في PB.
3. احتضان في 0.3٪ H₂O₂ في الميثانول لمدة 15 دقيقة.
4. يغسل 3 مرات بمحلول ملحي مخزن مؤقت (TBS).
5. احتضان 0.25٪ Triton X-100 في TBS لمدة 30 دقيقة.
6. كتلة مع مصل بقري عادي 10٪ (NBS) في 0.1٪ Triton X-100 في TBS لمدة 30 دقيقة.
7. احتضن بتخفيف 1: 1,000 من الأجسام المضادة الأولية للماعز ChAT المضادة للإنسان (انظر جدول المواد) في TBS مع 0.1٪ Triton X-100 و 1٪ NBS لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
8. اغسل 3 مرات في TBS في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء جميع عمليات الحضانة والغسيل في درجة حرارة الغرفة.
9. احتضان مع الجسم المضاد الثانوي للأبقار المضادة للماعز (انظر جدول المواد) لمدة 1 ساعة.
10. اغسل 3 مرات في TBS.
11. احتضان مع مركب أفيدين-بيوتين-بيروكسيداز (انظر جدول المواد).
12. اغسل 3 مرات في TBS.
13. التطوير باستخدام محلول ركيزة DAB بيروكسيداز محسن (انظر جدول المواد) وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    تحذير: DAB هو مادة مسرطنة مشتبه بها. إنه سام عن طريق التلامس والاستنشاق. استخدم معدات الوقاية الشخصية عند العمل مع DAB.
14. اغسل القسم عدة مرات بالماء المقطر واحتفظ به في Tris pH = 7.6.
15. قم بتركيب الأقسام على الشرائح الجيلاتينية. يمكن وضع جميع الأقسام من نسيج واحد على نفس الشريحة. جفف الأقسام في الهواء ، وقم بتجفيف 2x لمدة 5 دقائق لكل منها بنسبة 70٪ و 90٪ و 95٪ و 100٪ من الإيثانول ، ثم قم بتنظيف الأقسام بغسلتين لمدة 10 دقائق من الزيلين. قم بتغطية الأقسام باستخدام وسيط تركيب (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يؤثر وقت معالجة الجفاف والتطهير على سمك الأقسام. لذلك ، يجب استخدام نفس الشروط لجميع الأقسام. في الدراسة الحالية ، كان متوسط قيمة السماكة النهائية 21.11 ± 0.45 ميكرومتر.
16. احتفظ بالأقسام الموجودة في غطاء الدخان حتى تجف. الأقسام الجافة جاهزة للتعقيم.

النتائج

الشكل 1: رسم توضيحي لمعالجة الأنسجة وأخذ العينات المستخدمة في هذه الدراسة. تحضير العينة وأخذ العينات. (أ) تتم إزالة المخيخ والبصلة الشمية قبل تركيبها على قرص العينة. (ب) اتجاه الدماغ على قرص العينة لقطع القسم. يساعد الشق الطولي الضحل (المميز بخط) على نصف الكرة الأرضية على تحديد جانب الدماغ في الأقسام. (ج) رسم تخطيطي للوحة مكونة من 24 بئرا يوضح الاختيار المنهجي لكل قسم 8 من اللوحة المكونة من 24 بئرا (...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مجموعة ABC	مختبرات النواقلات	PK6100
الجسم المضاد ل ChAT	ميليبور ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية	AB144P
البقر المضاد للماعز IgG-B	سانتاكروز للتكنولوجيا الحيوية	SC-2347
مصل البقر للبالغين	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية	B9433
Cryostat	ليكا مايكروسيستمز ، بوفالو جروف ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية
محلول ملحي مخزن للفوسفات من دولبيكو	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية	D5652
جلايكول الإيثيلين	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية	324558
الجلسرين	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية	G2025
بيروكسيد الهيدروجين	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية	H1009
مجموعة Immpact-DAB	مختبرات النواقل	SK4105	محلول ركيزة DAB بيروكسيداز المحسن
الكيتامين	ويستوارد للأدوية ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية	0143-9509-01
مجهر	ليكا مايكروسيستمز ، بوفالو جروف ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية	AF6000	مجهزة بمسرح آلي وكاميرا رقمية ملونة IMI-tech
درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.) وسيط التضمين	علوم المجهر الإلكتروني ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية	62550-12
بارافورمالدهايد	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية	P6148
وسيط تركيب Permount	علوم المجهر الإلكتروني ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية	17986-01
تريتون X-100	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية	T8787
Trizma Base	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية	T1503	قاعدة تريس
تريزما هيدروكلوريد	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية	T5941	تريس هيدروكلوريد
زيلازين	باير ، ليفركوزن ، ألمانيا	رومبون
الزيلينات ، الدرجة النسيجية	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	534056