$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. امتصاص الدوبامين المشبكي
ملاحظة: هذا البروتوكول مخصص للتقييم المتوازي لدماغين ، ولكن يمكن استخدامه أيضا بنجاح لإجراء تجارب امتصاص الدوبامين المشبكي (DA) مع أربعة أدمغة بالتوازي.
- التحضيرات
- تسمية 48 أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل لكل جدول 1 (24 لكل دماغ). استخدم ألوانا مختلفة للأنابيب التي تنتمي إلى كل دماغ لمنع الالتباس بين العينات.
- تسمية 51 أنبوب تلألؤ # 1-51.
- ضع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) على الثلج. سيتم استخدام هذا للحفاظ على برودة العقول.
- قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي للسماح له بالتبريد المسبق إلى 4 درجات مئوية.
- قم بوزن أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة مسبقا للحصول على وزن الأنسجة الدقيق أثناء التحضير المشبكي (القسم 2.6).
- تحضير مخزن مؤقت للتجانس عن طريق خلط 4 ملي مولار HEPES و 0.32 م من السكروز. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 واستمر في وضع الثلج.
ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بالمخزن المؤقت للتجانس في حصص عند -20 درجة مئوية وإذابته في يوم التجربة.
- قم بإعداد مخزن الامتصاص من خلال الجمع بين ما يلي: 25 ملي مولار HEPES ، 120 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد كلوريد الصوديوم ، 1.2 ملي كلوريدالكالسيوم 2 ، 1.2 ملي ملي مجم4 ، 1 ملي مولار حمض الأسكوربيك (0.194 جم / لتر) ، 5 ملي مولار د-جلوكوز (0.991 جم / لتر). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (يؤدي إلى تركيز الصوديوم حوالي 130 ملليمتر) واستمر في وضع الثلج.
ملاحظه: بالنسبة إلى 2 دماغ، قم بإعداد 1500 مل من المخزن المؤقت للامتصاص. قم بإعداد محلول الامتصاص كمحلول مرق 10x بدون حمض الأسكوربيك والجلوكوز المحفوظ عند 4 درجات مئوية. اصنع محلول عمل 1x طازجا في اليوم ، مع استكمال حمض الأسكوربيك والجلوكوز. اضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم إلى 7.4.
- تحضير مخزن الامتصاص + الترابط من خلال الجمع بين ما يلي: 25 ملي مولار HEPES ، 120 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد كلوريد ، 1.2 ملي كلوريدالكالسيوم 2 ، 1.2 ملي مولار MgSO4 ، 1 ملي مولار حمض الأسكوربيك (0.194 جم / لتر) ، 5 ملي مولار د-جلوكوز (0.991 جم / لتر) ، 1 ميكرومتر بارجيلين ، 100 نانومتر ديسيبرامين ، 10 نانومتر مثبط Catechol-O-methyl-transferase (COMT). اضبط على الرقم الهيدروجيني 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم واستمر في وضع الثلج.
ملاحظه: استخدم 50 مل من المخزن المؤقت للامتصاص وأضف الترابط. يضاف البارجيلين للمساعدة في منع تدهور DA عن طريق الأكسدة من خلال أوكسيديز أحادي الأمين (MAO). يضاف مثبط COMT (RO-41-0960) لمنع تدهور DA (الكاتيكولامينات بشكل عام) من خلال COMT. يضاف ديسيبرامين لتثبيط الامتصاص من خلال ناقلات النورادرينالين والسيروتونين ، وبالتالي جعل نتائج الامتصاص خاصة بناقل الدوبامين (DAT).
- تحضير مخزن الامتصاص + الترابط + الكوكايين (coc) من خلال الجمع بين ما يلي: 25 ملي مولار HEPES ، 120 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.2 ملي كلوريدالكالسيوم 2 ، 1.2 ملي ملي MgSO4 ، 1 ملي مولار حمض الأسكوربيك (0.194 جم / لتر) ، 5 ملي مولار د-جلوكوز (0.991 جم / لتر) ، 1 ميكرومتر بارجيلين ، 100 نانومتر ديسيبرامين ، 10 نانومتر مثبط COMT ، 500 ميكرومتر كوكايين. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم واستمر في وضع الثلج.
ملاحظه: استخدم 7 مل من المخزن المؤقت للامتصاص + الترابط وأضف الكوكايين. يضاف الكوكايين للحصول على قياس خلفية لامتصاص DA غير المحدد للطرح من البيانات ، مع ترك امتصاص DAT الخاص فقط (نظرا لأن SERT و NET يتم تثبيطهما بواسطة الديسيبرامين ، كما هو موضح أعلاه). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مثبط DAT فعال للغاية ومحددا GBR-12935 بدلا من ذلك.
هام: احتفظ بكل شيء على الجليد من الآن فصاعدا.
- تحضير المشبكي
- ضحي بفأر واحد في كل مرة عن طريق خلع عنق الرحم وقطع الرأس.
- اقطع الجلد باستخدام المقص للكشف عن الجمجمة وقطع أي أنسجة زائدة خلف الجمجمة من قطع الرأس. قطع الجمجمة بمقص مستقيم صغير على طول sutura sagitalis ، وينتهي به الأمر إلى الأمام قدر الإمكان.
- ضع طرفي المقص في كل عين من عين الفأر واقطعي الجمجمة لإزالة ما تبقى من الجمجمة والدماغ السليم. قم بإزالة الدماغ بسرعة ووضعه في PBS المثلج. سيبقيه باردا أثناء تشريح الدماغ الثاني.
- باستخدام مصفوفة دماغية ، قم بتشريح شريحة إكليلية مقاس 3 مم من المخطط (الأمامي الخلفي: +1.5 مم إلى -1.5 مم) ، متبوعا بتشريح أدق باستخدام مثقب. انظر الشكل 1 لمنطقة الثقب.
- احتفظ بالأنسجة على الجليد في جميع الأوقات للمضي قدما.
- انقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل للوزن.
ملاحظه: سيتم استخدام هذا الوزن في الخطوة 1.2.14.
- كرر الخطوات 1.2.1-1.2.6 للدماغ الثاني.
- بمجرد الحصول على الوزن لكلا الدماغين ، انقل الأنسجة إلى زجاج تجانس يحتوي على 1 مل من محلول التجانس المثلج.
- تجانس الأنسجة باستخدام مدقة مدفوعة بمحرك عند 800 دورة في الدقيقة ، 10 ضربات متساوية.
ملاحظه: ضربة واحدة تساوي حركة واحدة لأعلى ولأسفل. يجب أن تكون السكتة الدماغية الأولى حوالي 5 ثوان ، 3-4 ثوان التالية. التجانس في وسط متساوي التوتر مهم لمنع انفجار المشبك العصبي. سيسمح استخدام القوة المناسبة والوسط متساوي التوتر للأطراف قبل المشبكية بإعادة إغلاق السيتوبلازم المغلق ، والحويصلات المشبكية ، والميتوكوندريا ، والهيكل الخلوي.
- انقل الجانس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واجمع المتجانس المتبقي من زجاج التجانس عن طريق شطفه بمخزن مؤقت إضافي للتجانس سعة 0.5 مل.
- احتفظ بالعينة على الجليد بينما تكون الأنسجة من الدماغ الآخر متجانسة. قم بتشغيل الدماغين بالتوازي في الخطوات 1.2.12-1.2.13.
- حبيبات النوى وحطام الخلية عن طريق الطرد المركزي (1,000 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية).
- انقل المادة الطافية (S1) (التي تحتوي على أغشية الخلايا والسيتوبلازم) إلى أنابيب جديدة للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية (التي تحتوي على السيتوبلازم) وأعد تعليق الحبيبات (P2) (التي تحتوي على المشابك العصبي الخام) في 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجانس / نسيج ملغي (بناء على الوزن الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.2.6). أعد تعليق الجزء المشبكي الخام برفق باستخدام ماصة p1000 ، لأن القوة الزائدة ستكسر المشابك العصبي.
ملاحظه: من المهم أن ينتهي بك الأمر ب 280 ميكرولتر على الأقل. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فسيكون من الضروري التخفيف بأكثر من 40 ميكرولتر لكل ملغ. يجب تنفيذ الخطوات 1.2.1-1.2.13 في أسرع وقت ممكن ، ويجب إبقاء كل شيء على الجليد. بمجرد إعادة تعليق المشبك العصبي الخام في مخزن التجانس ، فإنها تكون مستقرة إلى حد ما طالما أنها محفوظة على الجليد.
2. تجربة الامتصاص
- أضف 440 ميكرولتر من المخزن المؤقت للامتصاص + الترابط + الكوكايين إلى أنبوبي الطرد المركزي الدقيقين 12 1.5 مل ومخزن امتصاص 440 ميكرولتر + الترابط إلى 36 أنبوبا متبقيا من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل (انظر الجدول 1 للاطلاع على التخطيط).
ملاحظه: قم بإزالتها من الجليد قبل 15 دقيقة من بدء التجربة لإحضارها إلى درجة حرارة الغرفة ولكن استمر في وضع الثلج حتى ذلك الحين للحفاظ على المثبطات.
- تحضير منحنى التشبع (الدوبامين (2 ، 5 ، 6- [3H] -DA) (3-H الدوبامين) (91.1 Ci / mmol) بتركيزات نهائية مختلفة (0.031 ، 0.0625 ، 0.125 ، 0.25 ، 0.5 ، و 1.0 ميكرومتر)).
- قم بتسمية ستة أنابيب لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل على أنها 10 و 5 و 2.5 و 1.25 و 0.62 و 0.31.
- أضف 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للامتصاص + الترابط إلى 5 أنابيب طرد مركزي دقيقة بأقل عدد.
- أضف 1،455.4 ميكرولتر من محلول الامتصاص + الترابط ، 14.6 ميكرولتر من الدوبامين (1 ملليمتر) ، 30 ميكرولتر 3-H الدوبامين (11 ميكرومتر) إلى الأنبوب المسمى 10.
- انقل 750 ميكرولتر من الأنبوب المسمى 10 إلى الأنبوب المسمى 5. تخلط جيدا وتنقل 750 ميكرولتر من هذا الأنبوب إلى الأنبوب 2.5. كرر هذا التخفيف مع الأنابيب المتبقية.
- اشطف مسبقا مرشحات الألياف الدقيقة الزجاجية بمخزن مؤقت امتصاص 4 مل بعد وضعها على دلو مرشح 12 بئر.
- أضف 10 ميكرولتر من تعليق الغشاء المشبكي إلى أول 24 1.5 مل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (انظر الجدول 1 للتخطيط) التي تحتوي على 440 ميكرولتر عازلة. قم بالدوامة بعناية وتدور لأسفل بعد فترة وجيزة للتأكد من غمر الجسيمات العصبية في المخزن المؤقت. اتركيه في 37 درجة مئويةلمدة 10 دقائق
ملاحظه: من المهم أن تكون دقيقا في الأوقات أثناء تجربة الامتصاص لإجراء مقارنة عادلة بين الأدمغة. استخدم ساعة توقيت للدقة.
- أضف 50 ميكرولتر من الدوبامين بتركيزات 10 و 5 ميكرومتر (القسم 2.2) إلى العمودين الأولين واتركه عند 37 درجة مئويةلمدة 5 دقائق مع الرج. بعد 5 دقائق بالضبط ، أوقف التفاعل بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت لامتصاص الثلج. افعل الشيء نفسه مع التركيزات 2.5 و 1.25 ميكرومتر (القسم 2.2) ثم بتركيزات 0.62 و 0.31 ميكرومتر.
- أضف العينات إلى مرشحات الألياف الدقيقة المغسولة مسبقا واغسلها بمحلول امتصاص مثلج 5 × 4 مل عند إضافة أول 12 عينة إلى المرشحات ، انقل المرشحات إلى أنابيب التلألؤ. كرر هذا مع العينات ال 12 التالية.
- كرر الخطوات 2.4-2.6 للدماغ التالي.
- قم بإعداد 3 أنابيب عد قصوى عن طريق وضع مرشح من الألياف الدقيقة في قاع أنابيب التلألؤ 49-51 وإضافة 25 ميكرولتر من الحد الأقصى لتركيز الدوبامين في الأعلى (10 ميكرومتر).
- اترك جميع أنابيب التلألؤ البالغ عددها 51 في غطاء الدخان لمدة 1 ساعة.
- أضف 3 مل من سائل التلألؤ إلى كل أنبوب تلألؤ ورجه بقوة على شاكر لمدة 1 ساعة.
- عد [3ساعات] -DA في عداد بيتا لمدة 1 دقيقة.
- افتح البرنامج واختر: الملصق: H-3 ، اللوحة / الفلتر: قارورة 4 مل ، 4 × 6 ، نوع الفحص: عادي ووقت العد: 1 دقيقة
ملاحظه: يمكن تنفيذ هذه الخطوة في اليوم التالي إذا كانت أكثر ملاءمة. اترك العينات مغطاة بورق القصدير طوال الليل.
- تحديد البروتين
- استخدم مجموعة فحص البروتين BCA القياسية لتحديد تركيزات البروتين في المشابك العصبي للتعديلات من العدد في الدقيقة (النسخة الواحدة في الدقيقة) إلى fmol / min / μg والمقارنة المناسبة للامتصاص بين العينات.
< p class = "jove_title" >
3. تحليل البيانات
- استخدم البيانات من تجربة الامتصاص لعمل منحنى تشبع لكل مجموعة وحساب معدل التفاعل (Vmax) وثابت Michaelis Menten (KM).
ملاحظه: تعكس قيمةKM تركيز الركيزة المطلوب للوصول إلى نصفV كحد أقصى. وفقا لذلك ، يعكس Vmax بشكل مباشر وظيفة DAT (قدرة الامتصاص القصوى) ، والتي تعتمد على عدد DAT على السطح وعلى كيفية تعديل نشاطه عن طريق تعديلات ما بعد الترجمة و / أو البروتينات المتفاعلة وكذلك على التغيرات في تدرجات الأيونات. قيمةKM هي مقياس غير مباشر لتقارب الركيزة للناقل والذي ، من المهم أيضا ، تعديله عن طريق تعديلات ما بعد الترجمة و / أو البروتينات المتفاعلة. لتقييم التغييرات الوظيفية بشكل كامل ، من المهم تحديد مستويات التعبير السطحي مباشرة عن طريق ، على سبيل المثال ، اختبار البيوتينيل السطحي.
الجدول 1: تخطيط أنبوب الطرد المركزي الدقيق لإعداد المشبك.
10
5
2.5
1.25
0.62
0.31
10
5
2.5
1.25
0.62
0.31
10
5
2.5
1.25
0.62
0.31
10 + كوك
5 + COC
2.5 + كوك
1.25 + كوك
0.62 + كوك
0.31 + COC
