وضع العلامات على الخلايا العصبية الداخلية المملوءة بالسيتين الحيوي في شرائح الحصين الفئران للتصور

الملخص

المصدر: Economides، G.، et al. استعادة Biocytin وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد للخلايا العصبية الداخلية CA2 المملوءة في الحصين. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو إجراء تلطيخ شرائح دماغ الفئران الثابتة التي تحتوي على الخلايا العصبية الداخلية المملوءة بالسيتين الحيوي. يتضمن البروتوكول الحضانة بمركب أفيدين بيوتين (ABC) ، والتلوين باستخدام HRP والركيزة الكروموجينيكية ، والحفاظ على الهياكل باستخدام رابع أكسيد الأوزميوم ، وتضمين الأنسجة في الراتنج للتصوير.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية للحيوان المناسبة

فئة

1. تحديد محتوى البروتين أو البروتين المرتبط بالكالسيوم في الخلايا العصبية الداخلية وتصور Biocytin بعد التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية وملء Biocytin

ملاحظة: في نهاية التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية ، يتم تثبيت الشرائح التي تحتوي على خلايا مملوءة بالسيتين الحيوي طوال الليل قبل الإجراءات النسيجية. سيتم استبدال المحلول المثبت بتغيير واحد قدره 0.1 متر من الفوسفات في صباح اليوم التالي إذا تم تنفيذ باقي الإجراء في يوم آخر لمنع تلف الأنسجة. يجب أن يكون محلول التثبيت (4٪ بارافورمالدهيد ، محلول حمض البيكريك المشبع 0.2٪ ، محلول الجلوتارالديهايد 0.025٪ في محلول الفوسفات 0.1 M (PB)) طازجا في يوم التسجيلات للحصول على أفضل النتائج.

1. في نهاية التسجيل الفيزيولوجي الكهربي ، التقط بعناية الشريحة التي تحتوي على الخلية (الخلايا) المسجلة بفرشاة رسم وضعها في وعاء يحتوي على السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي (ACSF).
   ملاحظه: تم وصف تفاصيل البروتوكول المستخدم لإعداد الشرائح والتسجيلات داخل الخلايا باستخدام أقطاب كهربائية حادة سابقا.
2. في غطاء الدخان ، التقط شريحة الدماغ بعناية بفرشاة الرسم ولفها على قطعة صغيرة من ورق الترشيح عالي الجودة. ضع قطعة أخرى من ورق الترشيح المبلل على الشريحة وضع قطعتين من ورق الترشيح المبلل في وعاء بلاستيكي صغير يحتوي على 5-10 مل من محلول التثبيت واحفظه في الثلاجة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
3. تحضير محلول الجيلاتين في الماء المقطر. ضع 20 مل من الماء المقطر في دورق على طبق ساخن وقم بتسخينه إلى 60 درجة مئوية. أضف 2.4 جم من الجيلاتين تدريجيا إلى الماء ، وانتظر حتى يذوب ، واتركه يبرد إلى 35-40 درجة مئوية قبل الاستخدام لمنع تلف الأنسجة.
4. استبدل محلول التثبيت ب 2 مل من 0.1 M PB. ضع الشريحة في طبق بتري وقم بقطع أي أنسجة زائدة بشفرة مشرط. ضع الأنسجة المشذبة في طبق بتري (قطرها 9 سم ، ارتفاع 1.4 سم) ، مع التأكد من أنها مسطحة بدون طيات أو تجاعد ، وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد باستخدام فرشاة الرسم الجافة.
5. غطي المنديل بمحلول الجيلاتين الدافئ وضع طبق بتري على كتلة مجمدة لتبريد المحلول بسرعة.
6. باستخدام مصباح الزاوية لتوفير التباين ، انظر من خلال جانب الطبق وحافظ على الشريحة مسطحة باستخدام ضغط خفيف من فرشاة رسم دقيقة حتى يبدأ الجيلاتين في التماسك.
   ملاحظه: يمكن إعادة إذابة الجيلاتين إذا لم يكن النسيج مسطحا. يمكن إزالة أي عيوب على سطح الجيلاتين ناتجة عن إزالة فرشاة الرسم أثناء تصلبها عن طريق إذابة الطبقة السطحية برفق عن طريق تحريك لمبة المصباح بالقرب من السطح لبضع ثوان.
7. انقل طبق الجيلاتين إلى الثلاجة واتركه على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
8. في غطاء الدخان ، قم بقص كتلة صغيرة (~ 1 × 1 سم) تحتوي على أنسجة الطبق المضمنة بالجيلاتين باستخدام شفرة مشرط ، وارفع الكتلة باستخدام ملعقة صغيرة ، وضعها بعناية في نفس محلول التثبيت الطازج المستخدم لإصلاح الشرائح لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 4 درجات مئوية.
9. اغسل كتلة الجيلاتين في 5 مل من 0.1 M PB ثلاث مرات ، وجففها باستخدام قطعة من المناديل الورقية ، وألصق جانب الكتلة لأعلى (أي مع وجود الأنسجة في الأعلى) على ظرف اهتزاز باستخدام الغراء الفائق.
10. قم بإزالة الغراء الزائد بقطعة من ورق الترشيح واستخدم شفرة مشرط لقطع زوايا الكتلة ، تاركا شكلا ماسيا.
11. قسم الشريحة بسمك 50 ميكرومتر باستخدام اهتزاز وضع كل قسم بعناية في قارورة زجاجية تحتوي على 10٪ سكروز.
12. التقط قسما من القارورة بحذر ، وضعه بشكل مسطح في غطاء طبق بتري. باستخدام مجهر تشريح وشفرة مشرط جديدة ، قم بإزالة الجيلاتين من حول القسم وأعد القسم إلى قارورة تحتوي على 2 مل من السكروز الطازج بنسبة 10٪
    ملاحظه: من الضروري إزالة أكبر قدر ممكن من الجيلاتين في هذه المرحلة لتقليل انكماش الأنسجة أثناء خطوة الجفاف (الخطوة 1.37).
قم
13. بالتبريد بحماية الأقسام في محلول السكروز والجلسرين القائم على 0.1 M PB في درجة حرارة الغرفة عن طريق احتضانها لمدة 10 دقائق في محلول السكروز بنسبة 10٪ ، و 20 دقيقة في محلول السكروز -6٪ الجلسرين مرتين ، وأخيرا 30 دقيقة في محلول الجلسرين 30٪ السكروز -12٪ مرتين تحت التحريك المستمر.
14. ضع الأقسام بشكل مسطح على مستطيل صغير من رقائق القصدير باستخدام فرشاة الرسم. قم بإزالة أي سائل زائد من الأقسام وقم بطي رقائق القصدير بعناية في طرد.
15. أمسك الطرد بالقرب من سطح النيتروجين السائل دون لمس السطح لمدة 30 ثانية ثم اترك الأقسام تذوب تماما لمدة 30 ثانية تقريبا. كرر التجميد والذوبان مرتين أخريين.
16. قم بإزالة جميع الأقسام بفرشاة الرسم وضعها في قارورة زجاجية تحتوي على 2 مل من 0.1 M PB تحت التحريك المستمر لغسل السكروز الزائد.
17. قم بإزالة PB بماصة باستور واحتضان الأقسام في 2 مل من بيروكسيد الهيدروجين المائي 1٪ (H₂O₂) لمدة 30 دقيقة. اغسل الأقسام في 2 مل من 0.1 M PB 3x 5 دقائق.
18. قم بإزالة 0.1 M PB باستخدام ماصة باستور وأضف 1٪ بوروهيدريد الصوديوم (NaBH₄) في 0.1 M PB.
    ملاحظه: لا تقم بتغطية القارورة ، لأن محلول NaBH₄ ينبعث منه غاز الهيدروجين.
19. قم بإزالة بوروهيدريد الصوديوم بماصة باستور واغسل الأقسام جيدا في 2 مل من 0.1 M PB 5x 5 دقائق.
20. استبدل 0.1 M PB بمصل الماعز العادي بنسبة 10٪ في 0.1 M PB لمدة 30 دقيقة.
21. قم بإزالة مصل الماعز واحتضان الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية في خليط من الأجسام المضادة أحادية النسيلة والأرانب متعددة النسيلة المكونة من محلول ABC.
    ملاحظه: يتم عرض قائمة بالأجسام المضادة الأولية المستخدمة في الدراسات السابقة في الجدول 1.
22. احتضان الأقسام لمدة ساعتين في الظلام في خليط من الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلورسنت (جدول المواد).
23. قم بتركيب الأقسام على الشرائح في وسط التثبيت وقم بتغطيتها بغطاء غطاء.
24. التقط صورا لوضع العلامات الفلورية بتكبير 40X (الشكل 1Bb).
25. بعد التصوير الفلوري ، ضع الشريحة في طبق بتري زجاجي يحتوي على PBS وقم بإزالة الغطاء بعناية. ثم اغسل الأقسام من الشريحة باستخدام نبضات لطيفة من PBS من ماصة باستور. ضع الأقسام في قارورة زجاجية نظيفة تحتوي على PBS.
26. قم بإجراء تفاعل avidin-HRP عن طريق احتضان الأقسام أولا في ABC لمدة 2 ساعة على الأقل لتضخيم منتج تفاعل HRP.
27. تحضير محلول 3,5 ديامينوبنزيدين (DAB) عن طريق إضافة قرص واحد إلى 5 مل من الماء المقطر.
28. اغسل الأقسام باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق ثم باستخدام المخزن المؤقت Tris مرتين لمدة 10 دقائق.
29. أضف قطرة واحدة بسرعة من محلول NiCl₂ (كلوريد النيكل) بنسبة 8٪ إلى محلول DAB ، وقم بإدخال المحلول وخارجه للخلط ، وأضف بسرعة 1 مل من هذا المحلول فوق الأقسام. احتضان الأقسام في محلول DAB / NiCl₂ لمدة 15 دقيقة.
30. أضف 10 ميكرولتر من 1٪ H₂O₂ إلى محلول DAB. اسمح للتفاعل بالاستمرار في الظلام تحت التحريض المستمر لمدة 1 إلى 2 دقيقة تقريبا ، وراقب وضع العلامات على الخلايا المملوءة بمجهر تشريح.
31. أوقف التفاعل عن طريق إزالة محلول DAB / NiCl₂ / H₂O₂ وغسل الأقسام باستخدام محلول Tris المؤقت مرتين لمدة 5 دقائق.
32. في غطاء الدخان ، ضع دائرة صغيرة من ورق الترشيح في طبق بتري وقم بترطيبها ب 0.1 M PB. ارفع الأقسام واحدة تلو الأخرى من القارورة الزجاجية باستخدام فرشاة الرسم ، وضعها بعناية على الورق.
33. قم بتغطية الأقسام بدائرة أخرى مبللة من ورق الترشيح وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد عن طريق لمس المناديل الورقية برفق على السطح.
34. ضع 8-9 قطرات من رابع أكسيد الأوزميوم بنسبة 1٪ في 0.1 ميجا بيتابل على الورق العلوي ، وقم بتغطية الطبق ، واحتفظ به في غطاء الدخان لمدة 30 دقيقة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من 1 ساعة.
35. افتح طبق بتري وارفع ورق الترشيح العلوي. ارفع الأقسام بعناية واحدة تلو الأخرى باستخدام فرشاة الرسم ، وضعها في قارورة زجاجية ، واشطفها بالماء المقطر مرتين.
36. تخلص من نفايات رابع أكسيد الأوزميوم بشكل مناسب. اشطف جميع المعدات التي تستخدم لمرة واحدة وضعها في صناديق مناسبة.
37. ضع كل قسم بشكل مسطح على شريحة زجاجية وقم بتغطية الأقسام. انقل الشريحة إلى طبق بتري ، ضع قارورة زجاجية فارغة فوق الغطاء للاحتفاظ بها في مكانها ، وقم بتغطيتها بالكحول بنسبة 50٪. بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة الشريحة من المحلول وإزالة الأقسام من الشريحة. ضع الأقسام مرة أخرى على الشريحة ثم ضع الشريحة في كحول بنسبة 70٪ لمدة 15 دقيقة. كرر نفس العملية مع محلول كحول بنسبة 95٪ وأخيرا 100٪.
38. بعد خطوة الجفاف ، انقل الأقسام إلى قارورة زجاجية تحتوي على كحول بنسبة 100٪ على شاكر في غطاء الدخان. استبدل محلول الكحول بأكسيد البروبيلين (C₃H₆O) واغسله ثلاث مرات لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل الأخير ، احتفظ ب ~ 2 مل من أكسيد البروبيلين في القارورة وأضف الراتنج (نسبة 1: 1). تأكد من إذابة الراتنج واحتفظ بالأقسام تحت التحريك المستمر لمدة 30 دقيقة.
39. ضع كل قسم في لوشب من الألومنيوم يحتوي على راتنجات الايبوكسي باستخدام عصا خشبية واحتضنه طوال الليل.
    ملاحظة: لا تترك الأقسام الموجودة في الراتنج لمدة تزيد عن 24 ساعة لتجنب خطر إتلاف الأقسام.
40. ضع اللوح الخشبي فوق طبق ساخن لمدة 10 دقائق تقريبا. التقط كل قسم بعصا خشبية وضعه على شريحة نظيفة. حافظ على اتساق اتجاه كل قسم باستخدام مجهر تشريح. ضع غطاء على الأقسام. ضع الشريحة في الفرن لمدة 48 ساعة عند 56 درجة مئوية للمعالجة.

الجدول 1: جدول الحلول.

الحلول المستخدمة التكوين / التعليمات حل التثبيت 4٪ بارافورمالدهايد ، محلول حمض البيكريك المشبع 0.2٪ ، محلول جلوتارالديهايد 0.025٪ في محلول فوسفات 0.1 مولار (PB) 0.1 متر عازلة الفوسفات درجة الحموضة 7.6 أضف 100 مل من المخزون 1 م من الفوسفات إلى 900 مل من الماء المقطر محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.4 / 7.5 أضف 10 مل من محلول الفوسفات 0.1 ميجا ، و 0.2 جم من كلوريد كلوريد الكنتاجين ، و 8.76 جم من كلوريد الصوديوم إلى 990 مل من الماء المقطر الرقم الهيدروجيني العازل TRIS 7.5 قم بإذابة 5.72 جم من Tris Hydrochloride و 1.66 جم من Tris Base في 50 مل من الماء المقطر. ثم اصنع ما يصل إلى 1 لتر بالماء المقطر. محلول الجلوتارالديهايد المخزن ومحلول التثبيت بارافورمالدهيد 4٪ بارافورمالدهايد ، محلول حمض البيكريك المشبع 0.2٪ ، محلول جلوتارالديهايد 0.025٪ في محلول فوسفات 0.1 م. حل ABC يجب عمل المحلول قبل 30 دقيقة على الأقل من الاستخدام من مجموعة ABC. أضف قطرة واحدة من المحلول A وقطرة واحدة من المحلول B إلى 2.5 مل من PBS. راتنجات الايبوكسي دوركوبان: لصنع 20 وعاء: 20 جم من المكون A ، و 20 جم من المكون B ، و 0.6 جم من المكون C و 0.4 جم من المكون D- قم بحماية الميزان من الانسكابات عن طريق تغطية اللوحة بدائرة من ورق الترشيح. قم بوزن الكواشف بعناية في دورق ثلاثي بالنسب المذكورة أعلاه. تخلط جيدا عن طريق التقليب بقوة باستخدام عودين خشبيين لمدة 5 دقائق على الأقل. يجب أن يصبح الخليط بكثافة موحدة ، لون بني غامق. ضع الدورق في الفرن على درجة حرارة ~ 50 درجة مئوية لمدة أقصاها 10 دقائق لإزالة أكبر عدد ممكن من فقاعات الهواء. ملاحظه: سيبدأ الراتنج في التجفي إذا تركت الدورق في الفرن لمدة تزيد عن 10 دقائق. صب الراتنج في أواني بلاستيكية أو محاقن سعة 5 مل ، وقم بتأريخها ، وقم بتخزينها في الفريزر -20 درجة مئوية جاهزا للاستخدام.

النتائج

الشكل 1: عمليات إعادة البناء العصبية لنوعين من خلايا السلة المسجلة والمملوءة في منطقة CA2 الحصين والبيانات الفيزيولوجية الكهربية المرتبطة التي تم الحصول عليها بعد التسجيلات داخل الخلايا في المختبر . تم تعديل هذا الرقم من الدراسات السابقة. SO الطبقة oriens, SP الطبقة الهرمية, SR الطبقة الرادياتوم, SLM الطبقة الجزيئية الجزيئية. (أ) Aa: إعادة بناء خلية سلة ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أجسام مضادة لأفيدين-7-أمينو-4-ميثيل كومارين-3-حمض الخليك (أفيدين-أمكا) - 20.8 ملغم/مل مختبرات النواقل أ 2008 بيوسيتين ≥98٪ (TLC) سيغما ب 4261 3,5 أقراص ديامينوبينزيدين (DAB) لتحضير 5 مل سيغما د4293 راتنجات الايبوكسي دوركوبان أ سيغما 44611 [ا] راتنجات الايبوكسي دوركوبان ب سيغما 44612 [م] راتنجات الايبوكسي Durcupan C سيغما 44613 راتنجات الايبوكسي Durcupan D سيغما 44614 الإيثانول ، النقي ، المطلق ، ≥99.8٪ سيغما 32221 الجيلاتين سيغما هاتف: 48723 محلول الجلوتارالديهايد ، الدرجة الأولى ، 25٪ في H2O سيغما جي 5882 الجلسرين ، ≥99٪ سيغما جي 5516 مصل الماعز سيغما جي 9023 الماعز المضاد للفلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC) - 14.3 مجم / مل سيغما F2653 الماعز المضاد للأرانب تكساس ريد (TR) - 3.3 مجم / مل إنفيتروجين تي 2767 بيروكسيد الهيدروجين ، محلول 30٪ سيغما H-1009 زيت الغاطس، اللزوجة 1.250 سم مكعب (مضاءة) سيغما I0890 كلوريد النيكل سيغما N5756 رابع أكسيد الأوزميوم ، للفحص المجهري الإلكتروني ، 4٪ في الماء سيغما 75632 بارافورمالدهايد ، درجة الكاشف ، بلوري سيغما ص 6148 حمض البيكريك المبلل بالماء ≥98٪ سيغما 197378 عازلة الفوسفات 1 م سيغما ص 3619 أكسيد البروبيلين ، 99٪ ألفا إيسار 30765 رابع هيدروبورات الصوديوم VWR هاتف: 27885.134 سكروز فيشر علمي ش/8600/53 تريزما هيدروكلوريد ، ≥99.0٪ سيغما تي 5941 قاعدة تريزما ، ≥99.9٪ سيغما تي 6066 Vectashield وسيط تركيب مضاد للبهتان ، معامل الانكسار 1.45 مختبرات النواقل إتش -1000 مجموعة Vectastain Elite ABC HRP مختبرات النواقل PK6100 المعدات المستخدمة الاهتزاز أجار العلمية C4A ألواح الألومنيوم المقعرة شركة GA-MA & ASSOCIATES، INC. مجهر Leica DMR لايكا مايكروسيستمز X-Cite 120PC Q مصدر ضوء مضان تقنيات إكسليتاس كاميرا مجهر رقمي لايكا DFC450 لايكا مايكروسيستمز قلم الرسم الفني Rapidograph 0.18mm مركز الرسومات في لندن 0.18 مم منقار الرابيد مركز الرسومات في لندن قلم الرسم الفني Rapidograph 0.25mm مركز الرسومات في لندن 0.25 مم المنقار السريع مركز الرسومات في لندن نظام Neurolucida بما في ذلك محطة عمل الكمبيوتر والمسرح والكاميرا والجويستيك للتحكم في مرحلة XYZ مايكروبريجفيلد (MBF) العلوم البيولوجية إصدار برنامج Neurolucida 2017 مايكروبريجفيلد (MBF) العلوم البيولوجية جناح رسومات CorelDRAW X5 كوريل برنامج تحرير الفيديو أدوبي بريمير برو قوارير زجاجية 14 مل فيشر علمي